Биопленки кишечных микросимбионтов у детей с реактивным артритом

Реактивный артрит (РеА) — заболевание из группы спондилоартритов, которое характеризуется воспалительным поражением суставов, ассоциированным с триггерной инфекцией у генетически предрасположенных лиц [1]. В России среди ревматических заболеваний РеА у детей до 14 лет составляет 56%, у подростков — 37%. Как правило, РеА ассоциируется с острой или персистирующей кишечной инфекцией, вызываемой энтеробактериями, а также c носоглоточной и урогенитальной инфекцией [2]. Высокий риск развития рецидивов (от 15% до 75% пациентов) и недостаточная эффективность противовоспалительной терапии диктуют необходимость поиска биологических маркеров, позволяющих выявить микроорганизмы с артритогенным потенциалом, которые могут служить биомишенью для выбора средств эффективной терапии.

Наряду с генетической предрасположенностью, антигенной мимикрией, способствующими развитию воспалительных поражений суставов, в качестве одного из патогенетических механизмов формирования аутоиммунной патологии с поражением суставов рассматриваются нарушения состояния кишечного микробиома [3], гомеостаз которого обеспечивается различными факторами, включая межмикробные взаимодействия с формированием биопленок [4].

Доказано, что способность к биопленкообразованию (БПО) является базовым биологическим свойством, обеспечивающим стратегию выживания, сохранения и участия микросимбионтов в кишечном гомеостазе [4, 5]. Известно, что существование большинства видов микроорганизмов в природе происходит не в виде свободноживущих (планктонных) клеток, а путем организации ими специфических образований — биопленок: сообществ микробных клеток, прикрепленных к поверхности или друг к другу и заключенных в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ [6]. Способность к биопленкообразованию является одним из механизмов персистенции патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. С наличием биопленок связывают течение длительно рецидивирующих хронических инфекционных заболеваний, трудно поддающихся стандартной терапии [7]. Формирование биопленочных сообществ является одной из основных стратегий бактерий в экологической нише, которую они занимают. Бактерии в биопленках обладают повышенной защитой от действия антител, фагоцитов, противомикробных препаратов [7]. Биопленкообразование способствует защите микроорганизмов-ассоциантов от атакующих их иммунных клеточных и гуморальных факторов защиты, предоставляя возможность беспрепятственного проникновения в сосудистый кровоток с последующей транслокацией в синовиальную оболочку суставов, где формируются стойкие очаги эндогенной инфекции, которые трудно поддаются лечению антимикробными средствами и пробиотиками из-за неспособности дезорганизовать бактериальную биопленку ассоциантов — возбудителей воспалительного процесса. В этом случае наблюдается хронизация и рецидивирующее течение инфекционного процесса, требующие индивидуальной этиотропной терапии и коррекции нарушений нормальной микрофлоры больного [8].

Оценивая роль биопленкообразования в развитии воспалительных заболеваний различного генеза, установлено, что бактерии, колонизирующие организм больных с ревматическими заболеваниями, обладают способностью к образованию микробных биопленок с той же частотой, как и возбудители других воспалительных процессов [9]. Однако следует отметить, что указанные исследования проводились только в группе больных с деструктивным (ревматоидным) артритом, отличающимся по этиологии, патогенезу и клиническим проявлениям от реактивного артрита.

Принимая во внимание, что состояние микросимбиоценоза характеризуется межмикробными взаимодействиями, рассматривающимися в настоящее время с позиций биокоммуникативной активности микроорганизмов и триггерной роли микроорганизмов, и их антигенов в формировании РеА, целью работы явилась оценка уровня способности к биопленкообразованию микросимбионтов толстого кишечника у детей с РеА.

Материалы и методы исследования

Исследуемую группу составили 34 ребенка с РеА, в группу сравнения вошли 25 условно здоровых детей. Для постановки диагноза РеА использовали критерии IV Международного совещания по РеА (Берлин, 1999). Исследование микробиоценоза кишечника осуществлялось в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Идентификация микроорганизмов осуществлялась с помощью MALDI-TOF — масс-спектрометра «Microflex» («Bruker Daltonics», Германия). Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона от 1000 до 18 000 m/z (масса на заряд). При анализе белковых спектров микроорганизмов учитывали численный рейтинг точности (Score Value — SV) идентификации, представленный в виде логарифмической шкалы от 0 до 3. Полученные результаты сравнивали с базой данных Национального центра биотехнологической информации (Nacional Center for Biotechnology Information, NCBI).

Оценка состояния кишечного микробиоценоза по степеням проводилась в соответствии с Приказом МЗ РФ от 9 июня 2003 г. № 231.

Способность к БПО определяли по методике G. O’Toole с соавт. (2000). Выраженность биопленкообразования микроорганизмами оценивали по уровню экстракции (абсорбции) красителя этанолом, который измеряли на микропланшетном ридере ELx 808 (Bio Tek, США) при длине волны 630 нм. Биопленкообразование выражали в условных единицах, рассчитывая коэффициент биопленкообразования (КБПО): КБПО = ОДк/ОДб, где ОДк — оптическая плотность опытных проб и проб группы сравнения, а ОДб — оптическая плотность питательного бульона. Полученные данные статистически обработаны параметрическими и непараметрическими методами с использованием программы Statistica 10; достоверность различий между показателями соответствовала р < 0,05.

Результаты исследования

При бактериологическом исследовании микросимбиоценоза кишечника детей с РеА выявлено состояние эубиоза у 23,5 ± 7,2% детей, дисбиоз I степени — у 11,7 ± 5,6%, дисбиоз II степени — у 47,1 ± 8,6%, дисбиоз III степени — у 17,7 ± 6,6% больных. Тогда как в группе сравнения отмечалось преобладание детей с эубиозом — 41,2 ± 9,8%. Дисбиоз кишечника I степени, равно как и дисбиоз II степени, выявлен у 29,4 ± 6,2%. У большинства детей с РеА нарушения кишечного микросимбиоценоза характеризуются наличием дисбиотических нарушений и сопровождаются гиперколонизацией микросимбионтов-комменсалов, являющихся представителями ассоциативной микрофлоры: грампозитивных и грамнегативных энтеробактерий, клостридий, бактероидов, грибов рода

Показатели способности к биопленкообразованию микроорганизмов, выделенных из кишечника детей с РеА, в сравнении с группой условно здоровых детей представлены в табл.

При анализе представленных данных отмечаются следующие особенности. Выявлено достоверное снижение уровня БПО у штаммов бифидобактерий, являющихся представителями доминантной микрофлоры кишечного микросимбиоценоза, у детей с РеА. Показатель БПО бифидобактерий, выделенных от детей с РеА, оказался на 63% ниже по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей. В то же время у большей части микроорганизмов — представителей ассоциативной микрофлоры кишечника отмечается увеличение способности к БПО. Так, у штаммов клебсиелл, выделенных от детей с РеА, способность к БПО в 8 раз выше, чем у клебсиелл, выделенных от здоровых детей. Аналогично, способность к БПО у штаммов лактозонегативной кишечной палочки и грибов рода Candida от детей с РеА оказалась в 5 раз выше, чем у здоровых. Показатель БПО лактозопозитивной кишечной палочки и клостридий, выделенных у больных артритом, в 3 раза превышает данный показатель по сравнению со здоровыми детьми. У штаммов бактероидов, цитробактера и стафилококка отмечается повышение способности к БПО на 30–50% относительно группы сравнения.

В то же время снижение показателя БПО имело место у штаммов актиномицетов (в 8 раз) и пропионибактерий (в 2 раза), выделенных у больных детей.

Кроме того, у пациентов с РеА были выделены штаммы Cronobacter spp. и Bacillis spp., которые не высевались у здоровых детей. При этом данные микроорганизмы обладали высокой способностью к БПО (12,1 ± 0,1 у.е и 5,2 ± 0,9 у.е. соответственно).

Заключение

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить особенности микросимбиотического взаимодействия микроорганизмов кишечного биотопа детей с РеА, которые свидетельствуют о патогенетической роли способности микроорганизмов к БПО в формировании артритогенного потенциала и характеризуются следующими основными моментами.

У больных РеА выявлено нарушение микросимбиотических связей между микроорганизмами — представителями условно-патогеной микрофлоры (УПМ) и нормальной микрофлоры, что проявляется количественными и качественными нарушениями кишечного микросимбиоценоза.

Одним из важных показателей межмикробного взаимодействия является биопленкообразование, которое рассматривается как форма персистенции (выживания) патогенов и нормофлоры. Необходимо отметить, что микросимбиоценоз детей с РеА сопровождается увеличением уровня персистентных свойств ассоциативных микроорганизмов-комменсалов (способности к БПО) за счет усиления совокупного патогенного арсенала УПМ, выделенной из кишечника детей с артритом, с одной стороны, на фоне снижения способности к БПО у представителей нормальной микрофлоры — бифидобактерий, с другой стороны. Кроме того, микросимбиоценоз кишечника детей с РеА отличается появлением микроорганизмов?комменсалов, обладающих высокой способностью к БПО, но отсутствующих в кишечнике здоровых детей.

Выявленные особенности кишечной микробиоты детей с РеА раскрывают, в значительной степени, одну из важных причин недостаточной эффективности антибактериальной терапии артрита и предрасположенности РеА к рецидивированию и хронизации. Наличие у УПМ кишечника высокой способности к биопленкообразованию ведет к их укрытию от клеточных и гуморальных факторов защиты, а также препятствует проникновению антибактериальных препаратов внутрь биопленки, что ведет к формированию антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. В то же время антибактериальная терапия, являющаяся в настоящее время неотъ­емлемым компонентом терапии реактивного артрита, может способствовать развитию нарушения кишечного микробиоценоза, формируя порочный круг артритогенных факторов. Выходом из данной ситуации может служить персонализированный подход к лечению РеА, предупреждению его хронизации, а именно: коррекция нарушений кишечного микросимбиоценоза, использование лекарственных средств, ингибирующих процесс БПО или разрушающих уже сформированные биопленки. Таким образом, изучение биопленкообразования представляет интерес для практикующих врачей с точки зрения вклада этого биологического свойства в артритогенный потенциал кишечных микросимбионтов и возможности его использования в качестве биомишени для выбора эффективных лекарственных средств (антибактериальных, противовоспалительных препаратов, про- и пребиотиков).

Литература

1. Детская ревматология. Атлас. Под ред. А. А. Баранова, Е. И. Алексеевой. М.: Союз педиатров России. 2009. 248 с.
2. Алексеева Е. И., Жолобова Е. С. Реактивные артриты у детей // Вопросы современной педиатрии. 2003. Т. 1. № 1. С. 51–56.
3. Asquith M., Elewaut D., Lin P., Rosenbaum J. T. The role of the gut and microbes in the pathogenesis of spondyloarthritis // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. 2014. Vol. 28. № 5. P. 687–702.
4. Ohland C. L., Jobin С. Microbial activities and intestinal homeostasis: a delicate balance between health and disease // Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2015. Vol. 1. № 1. P. 28–40.
5. Бухарин О. В., Перунова Н. Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2014. 260 с.
6. Mulcahy L. R. Pseudomonas aeruginosa biofilms in disease // Microb Ecol. 2014. Vol. 68. № 1. P. 1–12.
7. Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина // Журн. микробиол. 2011. № 3. С. 99–109.
8. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II / Под ред. Лабинской А. С., Костюковой Н. Н., Ивановой С. М. М.: Издательство БИНОМ, 2012. 1152 с.
9. Малафеева Э. В., Гульнева М. Ю., Носков С. М., Романов В. А. Формирование биопленок условно-патогенными микроорганизмами, выделенными у больных с ревматическими заболеваниями // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. № 11. С. 53–55.

* ФГБУН ИКВС УрО РАН, Оренбург
** ФГБОУ ВО ОрГМУ, Оренбург

¹ Контактная информация: oech57@gmail.com

Биопленки кишечных микросимбионтов у детей с реактивным артритом/ О. Е. Челпаченко, Е. И. Данилова, И. Н. Чайникова, Н. Б. Перунова, Е. В. Иванова

Для цитирования: Лечащий врач № 4/2018; Номера страниц в выпуске: 56-58

Теги: кишечная микробиота, поражение суставов, воспаление