Показатели иммунитета у больных атопическим дерматитом с различными полиморфизмами в генах глутатион-S-трансфераз

Современное представление о том, что медицина должна быть превентивной, а лечение — максимально индивидуализированным, меняет взгляд на традиционное ведение заболеваний. Для осуществления превентивного подхода к развитию заболевания и к преду­преждению обострений необходимо иметь информацию о его молекулярном патогенезе, что позволит обосновать характер лечения и профилактики. Персонифицированная медицина учитывает не только индивидуальные генетические факторы, ассоциированные с развитием клинической картины, но и генетические факторы, влияющие на составление программы лечения и индивидуальной системы профилактики больного.

Атопический дерматит (АтД) — это наследственно обусловленный дерматоз с многофакторным патогенезом. В основе АтД лежит взаимодействие генетических и экзогенных факторов. Среди основных внешнесредовых факторов развития и тяжести течения АтД значатся неблагоприятная экологическая обстановка, лекарственные средства и пищевые аллергены. Влияние химических веществ на развитие АтД связано с вызванным ими иммунным дисбалансом, изменением метаболической активности и снижением барьерной функции органов и систем, при этом наследственная предрасположенность обусловливает особенности врожденного и адаптивного иммунитета. В связи с этим при формировании персонализированной программы лечения и профилактики необходимо учитывать наличие дефектов системы детоксикации в организме больного АтД.

Часто отмечается взаимосвязь интенсивности воздействия экзогенных факторов со степенью тяжести заболевания органов, выполняющих барьерные функции (печени, почек, стенки кишечника, кожи) и осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков, чужеродных веществ, имеющих токсичные свойства [1]. Воздействие ксенобиотиков нарушает тканевой метаболизм и физиологические свойства мембран клеток, влияет на функцию иммунной системы, что сопровождается изменением реактивности организма, снижением защитных свойств и уменьшением порога чувствительности к аллергенам [2]. Защитными механизмами адаптации к воздействию экзогенных и эндогенных ксенобиотиков являются механизмы элиминации и биотрансформации. Большинство ксенобиотиков липофильны, они легко адсорбируются и проникают через мембраны клеток, достигая активных клеточных центров, где и подвергаются биотрансформации. По такому же механизму происходит нейтрализация метаболитов, образующихся в результате как физиологических, так и патологических процессов: продуктов перекисного окисления липидов, активных форм кислорода и других биологически активных веществ [3].

Биотрансформация ксенобиотиков в организме происходит в результате двух функционально сопряженных фаз. В течение первой, несинтетической, фазы с помощью ферментов семейства цитохромов (основным является цито­хром Р450), а также ряда неспецифических эстераз, амидаз и монооксигеназ [4, 5] происходит окисление, восстановление или гидролиз ксенобиотиков. Во вторую фазу биотрансформации метаболиты подвергаются дальнейшей дезинтоксикации с последующей экскрецией. Биотрансформация может происходить в клетках печени, почек, кожи, стенке кишечника и в других органах.

Роль глутатион-S-трансфераз в процессах детоксикации

Важнейшую роль во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков играет группа ферментов глутатион-S-трансфераз (GST) — цитозольных и микросомальных. Цитозольные GST подразделяются на пять семейств с частично перекрывающейся субстратной активностью: альфа, мю (М), пи (Р), тэта (Т), зэта и кодируются 16-ю генами, локализованными на разных хромосомах. Классы глутатион-S-трансфераз различаются по своим физико-химическим, структурным, иммунологическим и энзиматическим свойствам. Их функция заключается в том числе в обеспечении метаболизма ряда эндогенных веществ, реализующих воспалительные и аллергические реакции. GST участвуют в дезактивации ксенобиотиков, нарушающих метаболизм и физиологические свойства клеток, в том числе воздействующих на иммунную систему. Поэтому нарушения функции GST сопровождаются изменением реактивности организма, снижением защитных свойств и уменьшением порога чувствительности к аллергенам [2, 6]. В этой связи наибольший интерес представляют нарушения функции цитоплазматических GST классов М1, Р1, Т1, которые участвуют в механизмах возникновения и развития аллергических реакций, в том числе и АтД, а их полиморфная экспрессия может предопределять клинический полиморфизм заболевания [7, 8]. Отмечено, что максимальный риск развития атопических заболеваний (в 9,5 раз выше общепопуляционного) зафиксирован для генотипа

GSTM10/0 GSTT10/0 GSTP1Ile/Ile [9]. Полиморфизм ферментов биотрансформации определяется наличием нескольких аллельных вариантов гена с разной метаболической активностью фермента. Полиморфная экспрессия ферментов предопределяет различную чувствительность к разным ксенобиотикам [10], что необходимо учитывать при составлении индивидуальной программы лечения и профилактики.

Наибольшая экспрессия гена GSTM1 наблюдается в печени, почках и желудке. В результате делеции около 15 т. п.н (тысяч пар нуклеотидов) гена GSTМ1, частота которой в популяции составляет 40–45%, образуются укороченные белковые продукты без выраженной ферментативной активности, что приводит к дисбалансу глутатион-опосредованной биотрансформации ксенобиотиков [11]. Противоположная ситуация описана R. A. McLellan et al., который при изучении индивидов с повышенной активностью GSTM1 выявил дупликацию гена [12]. Практический интерес представляют гомозиготные носители «нулевого аллеля», так как только в этом случае следует ожидать отсутствие в организме соответствующей активной GST. У гетерозигот 0/+ имеет место компенсация отсутствия одного активного аллеля за счет полноценного второго. GSTM1 имеет значение для развития онкологических заболеваний разных органов, психических заболеваний, патологии репродуктивной сферы. Имеются литературные данные, что нулевой аллель

GSTM1 модулирует течение аллергических реакций, в том числе атопического дерматита и бронхиальной астмы [13].

GSTT1 экспрессируется в печени и в эритроцитах. Ген GSTT1 существует в двух аллельных вариантах: функционально активном и неактивном, или «нулевом». В случае частичной или полной делеции гена GSTТ1, частота которой в популяции составляет 16–25%, образуется аллель GSTT1*0, с характерным снижением или даже полным отсутствием белкового продукта. Для наследования глютатионтрансферазы характерен эффект дозы. Гомозиготы GSTT1 0/0 полностью лишены соответствующего фермента, гетерозиготы GSTT1 +/0 имеют пониженную активность фермента («медленные конъюгаторы»), а в случае отсутствия делеции гомозиготы GSTT1 +/+ имеют нормальную глютатионтрансферазную способность («быстрые конъюгаторы»). Делеция GSTT1 способствует развитию поражения почек при диабете, а также отмечается при некоторых онкологических, гинекологических, психических заболеваниях.

Данные различных клинических исследований свидетельствуют, что наличие «нулевых» аллелей GSTM1 и GSTT1 у детей с АтД является неблагоприятным признаком: такие дети предрасположены к тяжелому течению АтД с диффузным поражением кожных покровов и частыми рецидивами [7, 14]. Вместе с тем результаты также свидетельствуют о том, что нуль-полиморфизм GSTT1 является генетическим фактором риска возникновения АтД [7], однако некоторые исследования других авторов утверждают обратное [15].

Роль GSTP1 в патогенезе АтД практически не изучена. Известно, что ген GSTP1 локализован на хромосоме 11 (11q13) и экспрессируется во всех органах и тканях, кроме эритроцитов. Этот фермент является основной GST в клетках плаценты и кожи. Особенностью GSTP1 является то, что кроме участия в клеточном метаболизме он выступает в качестве ингибитора группы JNKs-протеинкиназ, участвующих в процессах клеточной пролиферации и апоптоза. Поэтому отмечена его роль при развитии онкологических заболеваний и патологиях репродуктивной сферы. Описаны два диаллельных полиморфизма гена GSTP1. Один приводит к замене основания аденин на гуанин (A/G) в 313-м положении в 5-м экзоне, следствием чего является замена аминокислоты изолейцина на валин (Ile/Val) в 105-м положении пептида. При другом полиморфизме происходит замена цитозина на тимин (С/T) в 341-м положении в 6-м экзоне гена GSTP, в результате аминокислота аланин меняется на валин в 114-м положении (Ala/Val). При различных комбинациях этих полиморфизмов возможно 4 варианта аллелей: GSTP1*А — аллель «дикого» типа, который кодирует «активный» вариант фермента и измененные аллели — GSTP1*B, GSTP1*С, GSTP1*D, кодирующие «медленные» варианты белка.

Аллель GSTP1*A — кодирует белок, имеющий Ile в 105-м положении и Ala в 114-м. Аллель GSTP1*В представляет собой комбинацию Val в 105-м и Ala в 114-м положениях. Аллель

GSTP1*C имеет Val в 105-м и 114-м положениях. Аллель GSTP1*D характеризуется наличием в 105-м положении Ile и в 114-м — Val [5]. При сравнительном анализе аллели, кодирующие «медленные» варианты белка, можно объединять в одну группу.

Полиморфизм гена GSTP1 ассоциирован с развитием эндометриоза [16, 17]. У пациенток с преэклампсией выявлен более низкий уровень GSTP1 в плаценте, по сравнению с плацентой здоровых женщин, что позволило сделать предположение о роли этого фермента для снижения активности системы детоксикации [18].

Однако роль полиморфизма генов GSTP1 в развитии и тяжести протекания АтД изучена недостаточно. Взаимосвязь полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к АтД достаточно хорошо изучена в группах детей. Интерес к проведению этих исследований в первую очередь связан с большей чувствительностью детей к воздействию ксенобиотиков, вследствие генетически детерминированной повышенной проницаемости и нестабильности клеточных мембран, приводящих к аномальной направленности иммунного ответа [19]. Кроме того, активность ферментов биотрансформации у детей ниже, чем у взрослых, что приводит к более тяжелым последствиям воздействия токсических экзогенных и эндогенных веществ. Однако для реализации персонализированного подхода к терапии, прогнозированию течения АтД и индивидуальной системы профилактики следует учитывать генетические особенности пациентов и других возрастных групп.

Целью исследования было оценить степень нарушения процессов детоксикации путем иммунологического исследования уровней аутоантител к тканевым аутоантигенам органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у больных с АтД, имеющих различные полиморфные варианты генов GST.

Материалы и методы исследования

Генотипирование GSTM1, GSTP1 и GSTT1 и иммунологическое исследование проводилось у 40 больных АтД легкой и средней степени тяжести течения, в возрасте от 15 до 44 лет, 22 женщин и 18 мужчин, у которых на момент начала исследования или в анамнезе отсутствовали жалобы или анамнестические указания на какую-либо патологию органов ЖКТ.

У всех пациентов исследовали полиморфизмы генов, кодирующих различные виды GST. Типирование по генам GSTM1 и GSTT1 проводили на образцах ДНК, полученных из лимфоцитов периферической крови пациентов, путем мультиплексной ПЦР с использованием трех пар праймеров. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена HBB. Продукты амплификации фракционировали в 1,8% агарозном геле и визуализировали в УФ-свете. Гомозиготы по делеции генов GSTM1 и GSTT1 выявляли на электрофореграммах по отсутствию специфических фрагментов амплификации размером 215 п.н. и 418 п.н. соответственно. Типирование полиморфизма гена GSTP (Ile105Val A > G) проводили методом ПЦР-ПДРФ с рестриктазой BstMAI.

Определение уровней аутоантител к тканевым аутоантигенам органов ЖКТ проводилось в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа; определялись аутоантитела-маркеры изменений в стенках желудка (антитела к GaM-02) и тонкого кишечника (антитела к ItM-07); аутоантитела-маркеры изменений в ткани печени (антитела к HMMP — специфический компонент мембран митохондрий печени) и аутоантитела-маркеры изменений в поджелудочной железе (АТ к β-2-гликопротеину поджелудочной железы). Нормальные уровни аутоантител: от –20 до +10 опт. ед.

Результаты исследования

Исследуемая группа пациентов с АтД при генотипировании была разделена на 4 подгруппы с учетом имеющихся полиморфизмов в генах GSTM1, GSTT1 и GSTP.

• 1-я подгруппа «тяжелых полиморфных вариантов» включала 6 больных, имеющих два полиморфизма GSTT0/0 и GSTM0/0, а также GSTPVal/Val или GSTT0/0 и GSTM0/0 и GSTPIle/Val.
• 2-я подгруппа «полиморфизмов средней тяжести» включала 20 пациентов с наборами полиморфизмов:
  1) один GSTT0/0 или GSTM0/0 и GSTPIle/Ile;
  2) один GSTT0/0 и GSTPIle/Val или GSTM0/0 и GSTPIle/Val;
  3) только один GSTPVal/Val.
• 3-я подгруппа «легких полиморфных вариантов» включала 8 пациентов с полиморфизмом GSTPIle/Val, при GSTT1/1 или GSTM1/1.
• 4-я подгруппа «без полиморфных вариантов» не имела полиморфных вариантов генов GST, влияющих на их экспрессию, GSTT1/1, GSTM1/1, GSTPIle/Ile.

Результаты генотипирования, клинических и иммунологических исследований представлены в табл.

При клиническом исследовании выяснилось, что у больных с ранней манифестацией АтД (34 пациента) полиморфизмы генов GST, влияющие на экспрессию, встречаются достоверно чаще (р < 0,0001). У больных с отягощенным аллергологическим анамнезом (21 человек) полиморфизмы генов GST также выявлены достоверно чаще (р = 0,0017), и только у пациентов с отягощенным семейным анамнезом (13 пациентов) количество полиморфных вариантов достоверно не отличалось. Таким образом, у больных с длительным течением заболевания и явными признаками дефектов системы детоксикации полиморфизмы GST встречаются достоверно чаще.

Среди обследованных 40 больных полиморфизмы генов GST отсутствовали всего у 6 человек (15%), у остальных были выявлены генетические изменения, связанные с нарушением системы детоксикации. У 26 человек (65%) были выявлены наиболее значительные полиморфизмы генов GST: GSTT0/0 + GSTM0/0 + GSTPIle/Val, GSTT0/0 или GSTM0/0 + GSTPVal/Val (6 человек, или 15%); один GSTT0/0 или GSTM0/0 + GSTPIle/Val или один GSTPVal/Val (20 человек, или 50%). У этих больных были выявлены наиболее значительные отклонения от нормальных значений уровней аутоантител к тканевым аутоантигенам ЖКТ: к печени –26,23 ± 2,65, к тонкому кишечнику –23,19 ± 1,10 (табл.).

При этом у 6 человек с GSTT0/0 + GSTM0/0 + GSTPIle/Val, GSTT0/0 или GSTM0/0 + GSTPVal/Val выявлены максимальные изменения уровней аутоантител к печени: 31,67 ± 5,66 (р < 0,1) и к тонкому кишечнику: –23,67 ± 3,43 (р < 0,1); у 20 человек с одним GSTT0/0 или GSTM0/0 + GSTPIle/Val или одним GSTPVal/Val — аналогичные изменения, но выраженные в меньшей степени: аутоантител к печени: –25,88 ± 5,64 (р < 0,05), аутоантител к тонкому кишечнику: –21,88 ± 1,30 (р < 0,05).

У больных с выявленным полиморфизмом GSTPIle/Val (8 человек, или 20%) уровни аутоантител ко всем исследованным тканевым аутоантигенам ЖКТ оставались в пределах нормальных показателей. У больных, у которых не были выявлены никакие полиморфизмы генов GST, неожиданно были зафиксированы нарушения уровней аутоантител к тонкому кишечнику и желудку: соответственно –21,5 ± 1,45 и –22,81 ± 2,34 (р < 0,1), что может служить направлением дальнейших исследований в области изучения роли патологии ЖКТ в патогенезе АтД.

Выводы

У больных АтД имеются генетически детерминированные нарушения процессов детоксикации ксенобиотиков, что подтверждается обнаружением полиморфных вариантов генов GST, связанных со снижением функции ферментов детоксикации, а также изменениями показателей аутоиммунитета — одними из наиболее тонких стигматов раннего поражения органов и систем. Изменения сывороточных уровней аутоантител к тканевым аутоантигенам могут служить маркером ранней субклинической патологии органов ЖКТ у больных АтД и должны быть учтены при формировании комплексного персонализированного лечения пациентов с АтД, а также служить показателем его эффективности. Выявленные при помощи данной методики изменения (пониженные уровни специфических аутоантител к тканевым аутоантигенам органов ЖКТ) скорее всего носили метаболический характер и являлись следствием ухудшения клиренса соответствующих органов от продуктов естественного катаболизма. Таким образом, в состав комплексной терапии больных АтД с выявленными нарушениями системы детоксикации рекомендуется включать средства метаболической коррекции, механизм действия которых направлен на компенсацию нарушенной детоксицирующей функции печени, энтерогепатической циркуляции и структурно-функциональных повреждений органов гастроинтестинального тракта.

Литература

1. Экологические аспекты медицины / Под ред. Гичева Ю. П. Новосибирск,1995. 174 с.
2. Peden D. B. Development of atopy and asthma: candidate environmental influences and important periods of exposure // Environ Health Perspect. 2000. Jun; Vol.108 (Suppl 3). P. 475–482.
3. Hayes J. D., Strange R. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences // Pharmacology. 2000. Vol. 61, № 3. P. 154–166.
4. Ozawa S. Genetic polymorphisms in xenobiotic metabolizing enzymes as a determinant of susceptibility to environmental mutagens and carcinogens in humans // Yakugaku Zasshi. l997. Nov; Vol. 117 (10–11). P. 895–909.
5. Sipes I. G., Gandolfi A. J. Biotransformation of toxikants / Casarett and Doulls toxicology / Eds C. D. Klaassen, M. O. Admur, J. Doul. N. Y. Mac. Publ. Company, 1986. 192 p.
6. Ляхович В. В., Вавилин В. А., Макарова С. И. и др. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа // Вестник РАМН. 2000. № 12. С. 36–41.
7. Ляпунова А. А. Полиморфизм генов глутатион-S-трансфераз М1 и Т1 у детей с атопическим дерматитом. Дис. … к.м.н. Новосибирск, 2004. С. 26, 66–67.
8. Pavanello S., Clonfero E. Biomarkers of genotoxic risk and metabolic polymorphism // Med. Lav. 2000. Sep., Oct., Vol. 91 (5). P. 431–469.
9. Вавилин В. А., Макарова С. И., Сафронова О. Г. и др. Полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков и предрасположенность к атопическим заболеваниям у детей. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А. Б. Масленникова. Вып. 4. Новосибирск, Альфа Виста, 2003. С. 98–106.
10. Spiteri M. A., Bianco A., Strange R. C., Fryer A. A. Polymorphisms at the glutathione S-transferase, GSTP1 locus: a novel mechanism for susceptibility and development of atopic airway inflammation // Allergy. 2000. Vol. 55, Suppl 61. P. 15–20.
11. Xiao Z., Yang L., Xu Z., Zhang Y., Liu L., Nie L. et al. Glutathione S-transferases (GSTT1 and GSTM1) genes polymorphisms and the treatment response and prognosis in Chinese patients with de novo acute myeloid leukemia // Leuk Res. 2008, 32: 1288–1291.
12. McLellan R. A., Oscarson M., Alexandrie A.-K., Seidegard J., Evans D. A. P., Rannug A., Ingelman-Sundberg M. Characterization of a human glutathione S-transferase mu cluster containing a duplicated GSTM1 gene that causes ultrarapid enzyme activity // Molec. Pharm. 1997, 52: 958–965.
13. Ivaschenko T. E., Sideleva O. G., Baranov V. S. Glutathione S-transferase micro and theta gene polymorphisms as new risk factors of atopic bronchial asthma // J. Mol. Med. 2002. Vol. 80 (1). P. 39–43.
14. Беляева Л. М., Панулина Н. И., Микульчик Н. В. и др. Дифференциально-диагностические признаки изолированных и сочетанны форм атопических болезней у детей // Репродуктивное здоровье в Беларуси. 2010. № 5. С. 7.
15. Бахаев Д. В., Стенкова А. М., Иванова Ю. В. и др. Анализ полиморфизма генов интерлейкина-13 и системы детоксикации ксенобиотиков у детей с аллергопатологией // Тихоокеанский медицинский журнал. 2012. № 1. C. 63–65.
16. Ertunc D., Aban M., Nok E. C. et al. Glutathione S-transferase P1 gene polymorphism and susceptibility to endometriosis // Hum Reprod.2005, Aug; 20 (8): 2157–2161. Epub 2005 May 5.
17. Tuo Y., He J. Y., Yan W. J., Yang J. Association between CYP19 A1, GSTM1, GSTT1, and GSTP1 genetic polymorphisms and the development of endometriosis in a Chinese population // Genet Mol Res. 2016, Dec 19; 15 (4).
18. Gao H., Liu C., Lin P. et al. Effects of GSTP1 and GPX1 Polymorphisms on the Risk of Preeclampsia in Chinese Han Women // Cell Physiol Biochem. 2016; 39 (5): 2025–2032.
19. Головенко Н. Я. Механизмы реакций метаболизма ксенобиотиков в биологических мембранах. Киев. 1981. 219 с.

---

А. А. Кубанов*, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН
И. В. Кошелева*, доктор медицинских наук, профессор
М. В. Немцова**, доктор биологических наук, профессор
Л. И. Шадыжева*^{, 1}

* ФГБОУ ДПО РМАПО МЗ РФ, Москва
** ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова МЗ РФ, Москва

¹ Контактная информация: leyla.shadyzheva@gmail.com