Влияние пробиотиков на состояние защитного барьера и иммунную систему желудочно-кишечного тракта

Вовлеченность микробиоты организма человека в нашу жизнь, ее влияние на онтогенез c момента внутри­утробного развития до конца жизни, а также развитие человека как биологического вида поражает и поддерживает постоянный интерес к данной теме на протяжении последних ста лет. Основоположником науки о «полезных микроорганизмах» является лауреат Нобелевской премии за 1908 г. И. И. Мечников, который на заре становления иммунологии указывал на центральную роль биопленки из сотен видов микроорганизмов, покрывающих кожу и слизистые организма, в поддержании духовного и физического здоровья человека, его устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов.

За прошедшее столетие в изучении микробиоты были сделаны сотни открытий, позволивших уточнить ее роль и механизмы воздействия на организм человека, созданы сотни лекарственных препаратов и продуктов функционального питания, направленных на поддержание ее баланса. В настоящее время результаты анализа генетического материала, собранного в ходе реализации международного проекта «Микробиом человека», крупнейшими программами которого стали «Human Microbiome Project», реализуемый в США, и европейский проект «MetaHIT» [1], позволяют говорить о том, что микробиота человека включает до 10 тысяч микроорганизмов [2]. Большинство из них (88%) попадают в четыре филы (крупнейшие таксономические единицы бактерий и архей) — Bacteroides, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria [3]. Благодаря такому разнообразию объем генетического материала микроорганизмов, обитающих в организме человека, превышает 8 миллионов уникальных кодирующих генов, что в 360 раз больше, чем собственно человеческих (22 тысячи).

В начале текущего года была предпринята попытка развенчать миф о 10-кратном численном превосходстве представителей микробиоты над количеством клеток организма чело��ека, более 40 лет назад появившийся по результатам исследований микробиолога Томаса Лаки (1972) [4]. Группа израильских и канадских ученых установила, что организм «среднего человека» (с массой тела около 70 кг, в возрасте от 20 до 30 лет и ростом 1,7 метра) состоит из 30 триллионов клеток, а бактериальных клеток в его организме содержится 39 триллионов [5]. При этом у другого человека может быть в два раза больше или в два раза меньше бактерий, но наиболее вероятно, что соотношение близко к равному. Однако очевидно, что не численность, а состав и соотношение видов микроорганизмов играют решающую роль в системе «микробиота–хозяин».

Наиболее представительной и значимой для человека является микробиота желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В повседневной практике врач сталкивается с задачей выбора эффективных и безопасных средств для коррекции ее нарушений, уменьшения негативного воздействия проводимой терапии (в первую очередь антибактериальными и химиопрепаратами), а также стимуляции ее защитных функций, реализуемых как на локальном, так и системном уровне. Арсенал средств включает пробиотики, пребиотики, синбиотики и пробиотические продукты питания с доказанной эффективностью. Пробиотические бактерии реализуют свою функциональность на трех уровнях организма:

• первый — микробиота ЖКТ;
• второй — эпителиальный барьер ЖКТ;
• третий — иммунная система.

Количество пробиотических штаммов, а также лекарственных препаратов пробиотиков и пробиотических продуктов питания увеличивается год от года. Это существенно затрудняет выбор наиболее эффективного и требует анализа большого числа клинических и экспериментальных исследований.

В данной статье обобщены результаты экспериментальных исследований влияния пробиотического штамма L. casei DN-114001 (L. paracasei CNCMI-1518) на состав и метаболическую активность микробиоты, слизистый кишечный барьер и иммунную систему ЖКТ, а также клинических исследований профилактической эффективности пробиотического кисломолочного продукта (ПКП) Actimel, содержащего данный штамм в концентрации 1 × 10

⁸ КОЕ/мл.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на микробиоту желудочно-кишечного тракта

Воздействие пробиотиков на микробиоту ЖКТ многопланово. Наиболее изучены механизмы антагонистического влияния на факультативную микробиоту за счет снижения внутрипросветной pH, синтеза бактериоцинов и лантабиотиков, продукты микробного метаболизма (молочная кислота и короткоцепочечные жирные кислоты, перекись водорода, сероводород), конкуренции за пищевые субстраты и факторы роста, а также блокирование мест прикрепления и инвазии в слизистую оболочку.

Одним из наиболее ожидаемых результатов пробиотической терапии наряду с подавлением активности факультативной микробиоты является повышение количества фекальных лакто- и бифидобактерий, а также нормализация метаболической активности микробиоты ЖКТ.

В одном из первых исследований по оценке влияния пробиотического штамма L. сasei DN-114001 на микробиоту ЖКТ гнотобионтных крыс был отмечен рост популяции бифидобактерий, а также модулирована активность метаболических и энзиматических параметров [6]. Концентрации короткоцепочечных жирных кислот (уксусной, пропионовой и масляной) были значимо выше в группе животных, получавших ПКП с L. сasei DN-114001, в сравнении с особями, получавшими кисломолочный продукт без пробиотиков и молочное желе.

В рамках исследования Pedone исследована динамика содержания лактобактерий в фекалиях здоровых детей в возрасте 10–18 месяцев, получавших в течение 30 дней один из трех продуктов: молоко, ферментированное

L. bulgaricus и S. thermophilus, ПКП, содержащий L. сasei DN-114001, молочное желе [7]. Распределение детей проходило случайным образом, после 1-недельного вводного периода. Образцы кала собирали во время ввод­ного периода (D-8, D0), через 2 недели и 1 месяц приема продуктов (D15, D30) и в конце наблюдения (D38). Как показали результаты исследования, в группе, употреблявшей ПКП, содержащий L. сasei DN-114001, количество детей, имеющих популяцию Lactobacillus в концентрации выше 6log10 КОЕ/г, достоверно увеличилось с 18% до 68% (р < 0,05) в сравнении c другими группами. В этой же группе выявлено снижение активности β-глюкуронидазы и β-гликозидазы (р < 0,05), особенно у тех детей, у которых активность этих ферментов была первоначально высокой, что демонстрирует положительное влияние ПКП с L. casei DN-114001 на метаболическую активность кишечной флоры. Таким образом, представленные результаты показывают, что ПКП с L. casei DN-114001 может способствовать восстановлению баланса и метаболической активности кишечной микробиоты.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на слизистую оболочку кишечника

Защитный муциновый слой покрывает эпителий ЖКТ. Этот слой функционирует как активный барьер, который синтезируется и секретируется бокаловидными клетками [8]. Достоверное увеличение числа бокаловидных клеток кишечника происходит в результате включения в рацион питания животных (мышей) ПКП, содержащего

L. casei DN-114001 [9].

Первыми с пробиотиками в кишечнике взаимодействуют эпителиальные клетки кишечника (ЭКК). Повышение адгезивных свойств пробиотических бактерий может усилить их выживаемость в ЖКТ, обеспечивая лучшую активацию эпителиальных клеток кишечника [10].

Контакт пробиотических микроорганизмов с ЭКК является первым этапом, необходимым для трансдукции сигналов, которые стимулируют иммунный ответ в кишечнике, что было продемонстрировано для L. casei DN-114001 [9, 11]. В исследовании на мышах, получивших перорально суспензию L. casei DN-114001 (10⁹ КОЕ/мл), уже через 10 минут было отмечено взаимодействие данного пробиотического микроорганизма с микроворсинками энтероцитов, что проводило к активации ЭКК в виде увеличения числа мультивезикулярных телец в их цитоплазме [9].

Важную роль во взаимодействии пробиотических микроорганизмов с ЭКК играют toll-подобные рецепторы (TLR), стимуляция которых вызывает продукцию клетками ИЛ-6, ИЛ-1 и ИЛ-8 [12]. В исследовании C. M. Galdeano с соавт. (2009) степень активации ЭКК у мышей, получавших ПКП, содержащий L. casei DN-114001, оценивали путем измерения высвобождения ИЛ-6 из энтероцитов [9]. Было установлено существенное повышение продукции ИЛ-6, однако его уровень был ниже, чем в ответ на воздействие патогенных бактерий [13]. Данный цитокин инициирует и поддерживает взаимодействие ЭКК и иммунных клеток кишечника, а также участвует в индукции образования IgA в ходе клональной селекции B-клеток [14].

Непосредственное взаимодействие пробиотических микроорганизмов с ЭКК способно повышать их устойчивость к воздействию патогенных бактерий и вирусов. В исследовании M. Freitas с соавт. (2003) на модели эпителиальных клеток линии НТ29-ТХ была изучена способность L. casei DN-114001 препятствовать адгезии ротавируса [15]. Было показано, что инкубирование клеток кишечного эпителия линии НТ29-ТХ в среде, содержащей 20% надосадочной жидкости, взятой от культуры L. casei DN-114001, усиливало связывание β-галактозы со специфическими лектинами более чем на 60%, а также уменьшало инфицирование клеток ротавирусом на 70%.

В другом исследовании эпителиальные клетки кишечника человека линии Т84, инфицированные энтеропатогенной E. coli (ЕРЕС), инкубировали в присутствии L. casei DN-114001 в двух режимах: совместное инкубирование (патогенный и пробиотический штаммы одновременно инкубировали с клетками Т84) и постинфекционное (пробиотик добавляли через 3 ч после инфицирования патогенными бактериями) [16]. В обоих случаях совместное инкубирование в присутствии L. casei DN-114001 препятствовало снижению трансэпителиальной резистентности, вызванному E. coli, и одновременно ингибировало увеличение индуцированной энтеропатогенными кишечными палочками парацеллюлярной проницаемости.

Влияние Lactobacillus сasei DN-114001 на иммунную систему желудочно-кишечного тракта

Пробиотические бактерии или фрагменты их бактериальных стенок успешно взаимодействуют с многочисленными клетками иммунной системы кишечника. Однако иммунотропность пробиотических штаммов имеет существенные различия. Так, пробиотический штамм

L. casei CRL-431 вызывал увеличение количество клеток продуцентов IgA, дендритных клеток и макрофагов, но не оказывал значимого влияния на количество CD4⁺ или CD8⁺ Т-лимфоцитов в тонкой кишке [17]. Для штамма L. casei DN-114001, напротив, была продемонстрирована способность стимулировать не только активность IgA⁺ клеток, но также вызывать увеличение числа CD8⁺ и CD4⁺ лимфоцитов в биоптатах тонкой кишки [18].

Большое значение имеет изучение механизмов взаимодействия пробиотиков с системой врожденного иммунитета как первой универсальной линией иммунологической защиты организма. По данным C. M. Galdeano и G. Perdigon (2006), пробиотические бактерии вызывают активацию макрофагов и дендритных клеток [19, 20]. Говоря о влиянии пробиотических продуктов на систему врожденного иммунитета, можно привести данные исследования C. M. Galdeano с соавт. (2009), показавшего, что включение в рацион мышей ПКП с L. casei DN-114001 вызывало увеличение количества макрофагов в lamina propria по сравнению с животными без особого кормления, однако не влияло на количество дендритных клеток. При этом изменения количества макрофагов не были связаны с экспрессией клеточных рецепторов CD 206 и TLR-4 [9].

Пробиотические лактобактерии демонстрируют существенные отличия в способности индуцировать выделение дендритными клетками про- и противовоспалительных цитокинов. В работе H. R. Cristensen с соавт. (2002) была продемонстрирована способность

L. casei стимулировать продукцию ИЛ-6, ИЛ-12 и фактора некроза опухоли α (ФНО-α), а также экспрессию маркеров созревания ДК, тогда как штамм Lactobacillus reuteri характеризовался слабой цитокин-индуцирующей активностью и подавлял секрецию цитокинов и экспрессию маркеров созревания [21]. Полученные результаты позволяют предположить, что разные виды/штаммы лактобактерий могут оказывать различное влияние на функционирование дендритных клеток и таким образом осуществлять регуляцию первоначальных этапов иммунного ответа.

Учитывая тот факт, что ПКП являются элементом ежедневного рациона человека, эффекты их долговременного применения также требуют экспериментальной оценки. В исследовании, выполненном C. M. Galdeano и G. Perdigon (2004), включение ПКП, обогащенного L. casei DN-114001, в рацион мышей на длительный период (98 дней) сопровождалось увеличением концентрации ФНО-α и интерферона γ (ИФН-γ), секретируемых активированными Т-клетками, NK, макрофагами и ДК собственной пластинки кишечника [11].

Профилактическая эффективность кисломолочного продукта, обогащенного Lactobacillus сasei DN-114001

Инфекции ЖКТ традиционно являются объектом для оценки профилактической эффективности пробиотиков и ПКП. В многоцентровом исследования, проведенном C. A. Pedone с соавт. в 2000 году во Франции, принимали участие 928 детей в возрасте от 6 до 24 месяцев, из которых 463 получали пробиотический продукт, содержащий

L. casei DN-114001, а 465 — в качестве плацебо — традиционный йогурт [7]. В течение 12-недельного периода употребления изучаемых продуктов число детей, перенесших острые кишечные инфекции (ОКИ), было значительно ниже в группе, получавшей пробиотический продукт (15,9%), чем в группе, получавшей йогурт (22%) (р = 0,029). Кроме этого, после 12 недель исследования количество детей, у которых обнаруживали антиген ротавируса в кале, уменьшилось с 5,21% до 0,29% в 1-й группе, что достоверно более значимо, чем во 2-й группе — с 4,81% до 2,2%.

Второй по частоте применения пробиотиков является проблема профилактики антибиотико-ассоциированной диареи (ААД), в том числе Clostridium difficile-ассоциированной диареи. Кисло­молочный продукт, содержащий L. casei DN-114001, продемонстрировал высокую эффективность в профилактике ААД [22]. В ходе рандомизированного плацебо-контролируемого исследования было установлено, что на фоне системной антибактериальной терапии ААД возникла у 7 (12%) из 57 больных, получавших пробиотический продукт, по сравнению с 19 (34%) из 56 больных в группе плацебо (р = 0,007). Абсолютное снижение риска составило 21,6% (с доверительным интервалом (ДИ) от 6,6% до 36,6%), а необходимое число пролеченных больных для получения одного благоприятного или предупреждения одного неблагоприятного исхода (NTT) оказалось равно 5 (ДИ от 3 до 15). В основной группе участников не было выявлено ни одного случая

C. difficile-диареи. Напротив, в группе плацебо такая диарея имела место у 9 из 53 больных (17%) (p = 0,001). Абсолютное снижение риска C. difficile-диареи составило 17% (ДИ от 7% до 27%).

Большее число исследований посвящено оценке пробиотиков и пробиотических продуктов в профилактических и терапевтических программах при острых респираторных инфекциях у детей и взрослых. Оценка эффективности кисломолочного продукта, содержащего пробиотический штамм L. casei DN-114001, проводилась в исследовании DRINK [23]. В двойном слепом рандомизированном плацебо-контролируемом клиническом исследовании с сокрытием принадлежности субъектов к группе в округе Вашингтон (США) приняли участие 638 детей в возрасте 3–6 лет, посещающих детские сады или школы. Участники на протяжении 90 дней употребляли пробиотический продукт (основная группа) или продукт-плацебо без живой культуры. Установлено, что частота распространенных инфекционных заболеваний (острые респираторные заболевания + ОКИ) в основной группе (0,0782 случаев на 100 человеко-дней) была на 19% ниже, чем в группе плацебо (0,0986 случаев на 100 человеко-дней) (показатель заболеваемости — 0,81, 95% ДИ: 0,65; 099) (p = 0,046). Частота инфекций верхних дыхательных путей в основной группе (0,027 случая на 100 человеко-дней) была на 18% ниже, чем в группе плацебо (0,033 случая на 100 человеко-дней) (показатель частоты — 0,82, 95% ДИ: 0,68, 0,99, р = 0,036).

Заключение

Резюмируя представленные в статье данные, можно отметить, что за последние годы наши знания о микробиоте человека, механизмах действия пробиотиков значительно расширились, а содержащие их препараты и продукты питания прочно вошли в повседневную жизнь. Их адекватное использование может способствовать оптимизации состава кишечной микробиоты, что является важным и необходимым инструментом профилактики различных заболеваний и сохранения здоровья человека.

Литература

1. Электронный ресурс: http://www.genomeweb.com/node/1089736? hq_e=el&hq_m=1293079&hq_l=1&hq_v=8701270008.
2. Pflughoeft K. J., Versalovic J. Human Microbiome in Health and Disease // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2012; 7: 99–122.
3. Arumugam M. Enterotypes of the human gut microbiome // Nature. 2011; 473 (7346): 174–180.
4. Luckey T. Introduction to intestinal microecology // Am. J. Clin. Nutr. 1972; 25, 1292–1294.
5. Sender R., Fuchs S., Milo R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. bioRxiv preprint first posted online Jan. 6, 2016; doi: http://dx.doi.org/10.1101/036103.
6. Djouzi Z. The association of yogurts starters with Lactobacillus casei DN 114–001 in fermented milk alters the composition and metabolism of intestinal microflora in germ-free rats and in human flora-associated rats // Journal of Nutrition. 1997, 127: 2260–2266.
7. Pedone C. A., Arnaud C. C, Postaire E. R., Bouley C. F., Reinert P. Multicentric study of the effect of milk fermented by Lactobacillus casei on the incidence of diarrhea // Int. J. Clin. Prac. 2000; 54 (9): 568–571.
8. Mack D. R., Michail S., Wei S., McDougall L., Hollingsworth M. A. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression // Am. J. Physiol. 1999, 276, G941-G950.
9. Galdeano C. M., de Moreno de LeBlanc A., Carmuega E., Weill R., Perdigon G. Mechanisms involved in the immunostimulation by probiotic fermented milk // J. Dairy Res. 2009, 76, 446–454.
10. Bezkorovainy A. Probiotics: Determinants of survival and growth in the gut // Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 399 S-405 S.
11. Galdeano C. M., Perdigon G. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation // J. Appl. Microbiol. 2004, 97, 673–681.
12. Haller D., Bode C., Hammes W. P., Pfeifer A. M., Schiffrin E. J., Blum S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures // Gut. 2000, 47, 79–87.
13. Vinderola G., Matar C., Perdigon G. Role of intestinal epithelial cells in immune effects mediated by gram-positive probiotic bacteria: Involvement of Toll-like receptors // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12, 1075–1084.
14. Beagley K. W., Eldridge J. H., Aicher W. K., Mestecky J., Di Fabio S., Kiyono H., McGhee J. R. Peyer’s patch b cells with memory cell characteristics undergo terminal differentiation within 24 hours in response to interleukin-6 // Cytokine. 1991, 3, 107–116.
15. Freitas M., Tavan E., Thoreux К. et al. Lactobacillus casei DN 114–001 and Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 inhibit rotavirus infection by modulating apical glycosylation pattern of cultured human intestinal HT29-TX cells // Gastroenterol. 2004, 124 (Suppl 1): A475-A476.
16. Parassol N., Freitas M., Thoreux K. et al. Lactobacillus casei DN 114–001 inhibits the increase in paracel-lular permeability of enteropathogenic Escherichia coli-infected T84 cells // Res Microbiol. 2005, 156 (2): 256–262.
17. Galdeano C. M., de Moreno de LeBlanc A., Vinderola G., Bonet M. E., Perdigon G. Proposed model: Mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria // Clin. Vaccine. Immunol. 2007, 14, 485–492.
18. De Moreno de Leblanc A., Chaves S., Carmuega E., Weill R., Antoine J., Perdigon G. Effect of long-term continuous consumption of fermented milk containing probiotic bacteria on mucosal immunity and the activity of peritoneal macrophages // Immunobiology. 2008, 213, 97–108.
19. Galdeano C. M., Perdigon G. The probiotic bacterium lactobacillus casei induces activation of the gut mucosal immune system through innate immunity // Clin. Vaccine Immunol. 2006, 13, 219–226.
20. Wen H., Schaller M. A., Dou Y., Hogaboam C. M., Kunkel S. L. Dendritic cells at the interface of innate and acquired immunity: The role for epigenetic changes // J. Leukoc. Biol. 2008, 83, 439–446.
21. Cristensen H. R., Frokiaer H., Pestka J. J. Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells // J. Immunol. 2002; 168: p. 171–178.
22. Hickson M., D’Souza A., Muthu N. et al. Use of probiotic Lactobacillus preparation to prevent diarrhoea associated with antibiotics: randomised double blind placebo controlled trial // BMJ. 2007; 335: 80–85.
23. Merenstein D., Murphy M., Fokar A. et al. Use of a fermented dairy probiotic drink containing Lactobacillus casei (DN-114 001) to decrease the rate of illness in kids: the DRINK study A patient-oriented, double-blind, cluster-randomized, placebo-controlled, clinical trial // Eur J Clin Nutr. 2010 July; 64 (7): 669–677.

---

Д. В. Усенко¹, доктор медицинских наук
С. В. Николаева, кандидат медицинских наук

ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва

¹ Контактная информация: dusenko@rambler.ru