Иммуномодулирующая и репаративная терапия гриппа и острых респираторных инфекций у детей

В системе «наружных барьеров» слизистая оболочка верхних дыхательных путей представляет собой первую линию защиты организма против разнообразных патогенных факторов окружающей среды, таких как бактериальные, грибковые, вирусные, промышленные химические раздражители и загрязнения [1, 6]. Ответная реакция слизистой представлена двумя «эшелонами защиты»: 1) мукоцилиарным (или слизистый) — обеспечивающимся непосредственно цитологическим компонентом многорядного реснитчатого эпителия слизистой; 2) иммунным — включающим в себя клетки иммуноэпителиального ряда, отвечающих за выработку факторов местного иммунитета, и также состоящим из двух линий. Оба эти компонента взаимосвязаны и только их сочетанная и прогрессивная работа может положительно сказаться на основной защитной функции слизистой верхних дыхательных путей. Первый эшелон защиты напрямую зависит от степени взаимозамещения и активной пролиферации (регенерации) эпителия слизистой носа, для оценки которого установлены следующие факторы: количество нейтрофилов и плоского эпителия с оценкой характера расположения клеток в микропрепарате, вакуолизации цитоплазмы и ядер, дисхромии цитоплазмы и ядер, формы и размера клеток и ядер, наличия многоядерных клеток; 5 классов деструкции (0, 1, 2, 3, 4, 5) реснитчатого эпителия, индекс деструкции бокаловидных эпителиоцитов (ИДК), средний показатель деструкции бокаловидных эпителиоцитов (СПД), индекс цитолиза плоских эпителиоцитов (ИЦК). Причем три последних показателя имеют прямую корреляцию с уровнем секреторного иммуноглобулина А (sIgA), а степень деструкции реснитчатых эпителиоцитов зависит от нативной микрофлоры объекта [2, 5]. Поэтому оценка состояния перехода эпителиоцитов слизистой носовых ходов из одной формы в другую со степенью выраженности этих процессов показывает прямую регенераторную активность эпителия, зависящую как от внутренних, так и внешних факторов (лекарственных препаратов в том числе). Второй эшелон защиты — это «классический иммунный ответ» на внешнюю агрессивную среду с участием дендритных клеток слизистой носовых ходов. Секреторный IgA блокирует адгезию широкого спектра микроорганизмов к эпителиальным клеткам поверхности слизистой оболочки за счет углеводспецифических взаимодействий, не зависящих от специ­фичности молекулы IgA. Эффект sIgA в большой степени зависит от состояния нормальной микрофлоры, колонизирующей поверхность слизистой оболочки, и содержания во внешних секретах антимикробных веществ, таких как лактоферрин, лактопероксидаза, лизоцим и др. sIgA принимает участие в регуляции иммунного ответа, усиливая антибактериальную и противовирусную активность фагоцитов слизистой, что подтверждается показателями назограмм слизистой «первого эшелона защиты». sIgA осуществляют свои биологические функции в слое слизистого секрета муцина, подавляя колонизацию эпителия инфекционными агентами и сдерживая приток растворимых антигенов. Этот тип секреторного иммунитета слизистых представляет собой первую линию гуморальной защиты и обозначается термином «иммунное исключение», поскольку он предупреждает попадание чужеродных антигенов во внутреннюю среду организма и их взаимодействие с иммунной системой ограничивается поверхностью слизистых и кожных покровов. Вторая линия иммунной защиты формируется в слизистой оболочке посредством осуществления иммунного очищения (клиренса, элиминации), включая местную продукцию sIgA, способного ограничить распространение чужеродных антигенов. sIgA фиксируются антигенсвязывающим центром на корпускулярных объектах и, таким образом, опсонизируют микроорганизмы. Нейтрализующее действие антител осуществляется в присутствии макрофагов и нейтрофилов. Сочетание нейтрофилов с опсонинами создает условия для более эффективной реализации антимикробных функций нейтрофилов. Наиболее часто в качестве опсонинов для нейтрофилов выступают антитела IgG, при этом образуется один из самых прочных барьеров для гноеродных бактерий и вирусов. Таким образом, сочетанная оценка всех факторов защиты слизистой носовых ходов в педиатрии (наиболее доступным контингентом в клинической практике) позволяет оценить не только иммунный ответ, но и степень выраженности регенераторного процесса в слизистой как основополагающего фактора при формировании всех линий иммунного ответа, что является наиболее актуальным [1].

Анализ литературных данных [1–3] показал, что стандартное курсовое применение разнообразной местной иммуномодулирующей терапии (Гриппферон, жидкий интерферон человеческий лейкоцитарный) для нивелирования назофарингеального синдрома острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) не приводило к сокращению сроков выздоровления пациента, но вполне достаточно оказывало заявленный эффект уменьшения назальной воспалительной секреции. Проводилась оценка мазков-отпечатков на степень деструкции эпителиоцитов слизистой, но результаты исследований были не утешительны — они свидетельствовали о том, что слизистая была поражена и репарационной активности не наблюдалось. В итоге одной из задач данного исследования стала оценка зависимости сроков выздоровления детей с назофарингеальным синдромом ОРВИ от выраженности репарационной активности эпителия слизистой верхних дыхательных путей.

Прямая зависимость активации toll-9 рецепторов ДНК эукариот [4], стимулирующей выработку секреторного иммуноглобулина А в слизистой верхних дыхательных путей, представляется актуальной в изучении влияния дезоксирибонуклеата натрия на репарационные возможности эпителия.

В данном аспекте представляет интерес отечественный препарат природного происхождения Деринат®, действующим веществом которого является дезоксирибонуклеат натрия. Препарат стимулирует регенерацию и репаративные процессы, оказывает модулирующее действие на системный и локальный иммунитет, уменьшает выраженность воспалительных процессов. Иммуномодулирующий эффект обусловлен взаимодействием действующего вещества препарата с патоген-распознающими рецепторами (TLR-9) на иммунокомпетентных клетках, что приводит к последующей активации целого ряда иммунных механизмов [4]. Включение этих механизмов в свою очередь приводит к стимулированию процессинга и активации как В-, так и Т-звена иммунного ответа, к усилению активности NK-клеток и фагоцитов. Параллельно этому включаются механизмы опосредованного TLR-взаимодействия компенсаторной пролиферации клеток-предшественников эпителия и мезенхимальных клеток после повреждения [5, 6].

Принимая во внимание весь спектр биологических эффектов препарата Деринат®, представляется перспективным его использование в терапии острых респираторных вирусных инфекций у детей.

Целью исследования было оценить эффективность местного применения 0,25%-го раствора дезоксирибонуклеата натрия для наружного и местного применения, направленную на реализацию как регенераторной, так и иммунной функций слизистой носовых ходов у детей.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись дети в возрасте от 3 до 14 лет, которые впервые обратились к доктору в течение последнего одного месяца по симптоматике острого респираторного заболевания, ранее также в течение одного месяца не применялась какая-либо противовирусная и иммуномодулирующая терапия, а также адекватно оценивали свое состояние и имели подписанное информированное согласие законного представителя ребенка на участие в исследовании. В группу исключения попадали пациенты со следующими критериями: поливалентная аллергия в анамнезе; индивидуальная непереносимость; наличие заболеваний, требующих назначения противовирусной и иммуномодулирующей терапии; участие в каких-либо клинических исследованиях в течение предыдущего месяца.

В исследовании использовался метод стратификационной рандомизации [3, 5], что обеспечило однородность выборок групп по всем основным признакам: возрасту, полу, частоте заболеваний за период исследования, фоновой патологии. Таким образом, было сформировано две группы пациентов:

• группа 1 — «контрольная» — условно здоровые дети, данные исследования которых использовались как базовый контрольный уровень (118 человек);
• группа 2 — «основная» — дети (127 человек), у которых применялся препарат Деринат®, раствор для наружного и местного применения 0,25% в стандартной схеме терапии ОРВИ (препарат закапывают интраназально по 2–3 капли в каждый носовой ход через каждые 2 часа в течение первых 2 суток; далее — по 2–3 капли в каждый носовой ход 3–4 раза в день, продолжительность курса — 7 дней).

Критерием выбора временных промежутков оценки результатов исследования и забора материала для изучения являлось завершение курса применения препарата и наличие стойкой клинической положительной динамики выздоровления пациента. Перед началом проведения исследования для оценки состояния здоровья ребенка был проведен осмотр и опрос, отражающий перинатальный период, характер вскармливания, наследственный и отягощенный анамнез, частоту заболеваний в год, наличие хронических заболеваний и т. д. Учитывались все сведения по пробе Манту в динамике, переносимость лекарственных препаратов и прививок согласно Национальному прививочному календарю, длительность и эффективность применяемой профилактической терапии. Всем детям была проведена оценка физического развития. Вес и рост измеряли стандартными методами в условиях медицинского кабинета в дошкольном учреждении. Индекс массы тела (ИМТ) определяли по методу Ketle:

ИМТ = масса тела/(длина тела)² = кг/м².

В качестве стандартных показателей физического развития использовались региональные стандарты (Нормативные показатели физического развития детей Воронежского региона, утверждены МЗ России, 2002 г.).

Микробиологическое исследование проводилось в два этапа: до начала исследования и после завершения терапии (у контрольной группы — спустя 1 месяц). Забор материала для микробиологического исследования проводился согласно нормативным актам МЗ РФ: ватно-марлевыми тампонами с поверхности слизистой носа и глоточной миндалины после первичного посещения пациента участкового врача-педиатра и установления критейности участия в исследовании до начала применения препаратов и после окончания курса применения препарата. Всю микрофлору, определяемую при бактериологическом исследовании, принято разделять на индигенную (нормальную или низкопатогенную) КОЕ/мл, добавочную (условно- или среднепатогенную) и транзиторную (патогенную). Степень обсеменения должна быть не ниже и не выше 10⁴–10⁶, 10¹–10⁴, 10¹–10² соответственно.

Иммунологическое исследование заключалось в определении концентрации секреторного иммуноглобулина А в носовых смывах (вращательным движением ватного зонда, смоченного в 0,9% растворе NaCl, собирают в одну пробирку выделения из обеих ноздрей исследуемого) и осуществлялось методом иммуноферментного анализа.

Цитологическое исследование: метод мазков-отпечатков со слизистой носа (забор мазка ватным тампоном, смоченном в стерильном физиологическом растворе, на уровне нижних носовых раковин) проводился следующим образом: вращательными движениями без надавливания наносили мазки на обезжиренные стекла, высушивали, фиксировали и окрашивали по Романовскому–Гимзе. Микроскопию проводили под иммерсией при увеличении (окуляр — 7, объектив — 90). Подсчитывали 200 клеток. В назоцитограммах определяли количество нейтрофилов и плоского эпителия с оценкой характера расположения клеток в микропрепарате, вакуолизации цитоплазмы и ядер, дисхромии цитоплазмы и ядер, формы и размера клеток и ядер, наличия многоядерных клеток. Для оценки деструктивных процессов согласно методике, предложенной Л. А. Матвеевой, в слизистой носа определяли 5 классов деструкции (0, 1, 2, 3, 4, 5), индекс деструкции клеток (ИДК), средний показатель деструкции (СПД), индекс цитолиза клеток (ИЦК).

Математические методы: статистическая обработка полученных данных проводилась в два этапа. На первом этапе показатели, полученные в ходе обследования, фиксировались и заносились в базу данных. На втором этапе осуществлялась статистическая обработка результатов с использованием стандартного пакета программ статистического анализа Statistica 6.0. Для статистического анализа и описания результатов исследования применяются основные показатели: средняя арифметическая величина (М), среднее квадратичное отклонение (σ), средняя ошибка (m) среднеарифметической (М). А также методы вариационной статистики, дисперсионный, корреляционный и регрессионные анализы.

Парный двухвыборочный t-тест Стьюдента использовался для проверки гипотезы о различии средних для двух выборок данных. В нем не предполагалось равенство дисперсий генеральных совокупностей, из которых выбирались данные исследования. Парный тест использовался, когда устанавливалась естественная парность наблюдений в выборках. С другой стороны, средние значения mi-распределений могли меняться под влиянием некоторых факторов, входящих в эксперимент. Целью исследования являлось исследование изменчивости средних значений показателей у детей.

Результаты исследования

Предварительный анализ состояния участников исследования в основной группе выявил, что у подавляющего большинства обследованных детей отмечается наличие от одного до трех заболеваний в анамнезе, что свидетельствует о значительном снижении защитных сил детского организма. Количество детей с хроническими заболевания вне обострения на момент первичного осмотра составило 42,8% (63 человека). Хронические инфекции ЛОР-органов отмечались у 59 дошкольников (хронический аденоидит у 35 (11,5%) детей, хронический тонзиллит у 43 (10,9%) детей). В большинстве случаев они были обусловлены смешанными хроническими вирусно-бактериальными инфекциями.

Микробиологический анализ у всех пациентов до начала исследования показал, что нормальная микрофлора носоглотки во всех группах была представлена α-гемолитическими стрептококками (

Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus faecium, Streptococcus uberis), нейссериями (Neisseria sicca, Neisseria mucosa, Neisseria lactamica, Neisseria flava, Neisseria subflava) и некоторыми анаэробными бактериями (Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella melaninogenica), однако степень ее обсеменения составила в среднем 10² КОЕ/мл, при норме (в первой группе) не ниже 10⁴ КОЕ/мл. Данные результаты могут быть также расценены как проявления дисбиоза и косвенно служить признаком наличия патологического процесса в носоглотке. Индигенная микрофлора — это один из основных компонентов неспеци­фического иммунитета человека, что получило научное обоснование в феномене бактериальной интерференции. Снижение количества индигенной микрофлоры провоцирует избыточный рост добавочной микрофлоры, что и прослеживается в настоящей работе. При этом патогенная флора была представлена сравнительно одинаковыми популяциями во всех группах исследования: но у пациентов, получавших препарат Деринат®, интенсивность роста S. aureus составила не более 10⁴ КОЕ/мл. Аналогичная степень обсеменения отмечалась у H. influenzae и Streptococcus pneumoniae во всех случаях. K. pneumoniae и M. catarrhalis во всех группах дали рост на уровне 10⁵–10⁶ КОЕ/мл. В значительном проценте случаев выявлены дисбиотические изменения за счет высокого роста добавочной микрофлоры: среднепатогенные α-гемолитические стрептококки ( Streptococcus suis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis и др.) со степенью обсеменения более 10⁴ КОЕ/мл были выделены у 73 (51%). У всех пациентов определялся низкий рост дрожжеподобных грибов рода Candida, чувствительных к снижению pH секрета в носоглотке. Рост был получен у 17 (12%) со степенью обсеменения, не превышающей 10³ КОЕ/мл. Рост монокультуры обнаружился в 60,3% случаев, в 16,1% высевались две культуры бактерий. В подавляющем большинстве случаев Сandida albicans обнаруживалась в сочетании с бактериальной флорой (чаще в ассоциации со стафилококком). В 86% посевов степень обсемененности высокая. Роста бактерий не обнаружено в 8,7% случаев. Полученные данные характерны для детской популяции в целом и очень широко распространены (определяются в посеве материала из носоглотки до 70% случаев), и далеко не каждый ребенок имеет выраженную симптоматику воспалительного процесса. Однако данные микроорганизмы имеют наибольшее разнообразие факторов патогенности и у большинства детей проявляются, как правило, частыми простудными заболеваниями.

Анализ результатов бактериологического исследования по окончании курсовой схемы терапии выявил у пациентов основной группы, получавших Деринат®, положительную динамику. Так, по данным посева преимущественно преобладала индигенная микрофлора, интенсивность обсеменения составила 10

⁴–10⁶ КОЕ/мл. Таким образом, применение препарата Деринат®, раствор 0,25% приводит к устранению дисбиотических проявлений, нормализации микрофлоры носоглотки ребенка.

Результаты иммунологического исследования показали (табл. 1), что у детей контрольной группы этот показатель спустя 7 дней не менялся по сравнению с данными начала исследования и составлял 1,24 ± 0,2 и 1,24 ± 0,19 пг/мл соответственно.

При этом у детей основной группы 2 уровень секреторного иммуноглобулина А после 7-дневного применения препарата Деринат®, раствор 0,25% достоверно возрастал с начального 0,87 ± 0,1 до 1,65 ± 0,01 пг/мл (рис. 1). Корреляционный анализ значений уровня секреторного иммуноглобулина А показал, что этот показатель у основной группы обладает сильными положительными связями с 1-м и 3-м классами деструкции эпителиоцитов (r = 0,8), с индексом цитолиза клеток (r = 0,9) и с индексом модуляции клеток плоского эпителия (r = 0,8).

Анализ цитологического мазка-отпечатка (рис. 2) в контрольной группе до начала исследования и спустя 7 суток не выявил существенных достоверных различий с эпителиальным слоем слизистой носовых ходов. Индекс цитолиза клеток не менялся и составил 0,04; модуляция клеток плоского эпителия была стабильна и составляла 0,41, наиболее мелкий класс деструкции доминировал в процентном соотношении относительно всего массива клеток с деструкцией, пикноморфные ядра не визуализировались, тинкториальных изменений не выявлено — все это свидетельствовало о наличии слабого естественного регенераторного процесса слизистой носовых ходов у обследуемых контрольной группы.

В группе 2 до начала исследования установлено резкое снижение репаративного свойства эпителиоцитов слизистой носовых ходов (табл. 1, рис. 3): доминировали эпителиоциты 1-го, 3-го, 4-го и особенно 5-го типа деструкции клеток (с выраженными пикноморфными единицами в ядрах).

Средний показатель деструкции был высоким и составил 0,72 единицы. При этом стоит отметить, что низкий уровень секреторного иммуноглобулина в основной группе 2 коррелировал с высокими результатами показателей деструкции эпителиоцитов: СПД (r = 0,8), ИМК (r = 0,7) и 1–5 классы деструкции эпителиоцитов (r = 0,8).

Спустя 7 суток после начала терапии препаратом Деринат®, раствор 0,25% цитологическое исследование показало (табл. 1, рис. 4), что достоверно на 65% возрос индекс модуляции эпителиальных клеток на фоне достоверного снижения 1-го класса деструктивных эпителиоцитов почти в 3 раза. Полностью в мазках отсутствовали пикноморфные ядра клеток. Данные изменения состояния эпителиоцитов коррелировали с уровнем секреторного иммуноглобулина А, что напрямую свидетельствовало о высокой степени репарации слизистой, вызванной курсовым применением препарата Деринат®, раствор для наружного и местного применения 0,25%.

Полученные результаты цитологического исследования позволили создать математическую модель величины репарации слизистой носовых ходов на фоне применения любого препарата, т. к. правильная оценка степени репарации позволит дать довольно достоверный и точный прогноз дальнейшего развития клиники течения той или иной нозологии, связанной с вирусной или бактериальной инфекцией.

За основу вычисления коэффициента репарации слизистой верхних дыхательных путей был взят обобщенный логарифмический показатель, который вычислялся с использованием формулы логарифмической зависимости:

где M_i и M_0i — учитываемые показатели i в эксперименте и в норме, σ_0i — средняя квадратичная погрешность показателя i в норме.

Результаты вычисленного коэффициента можно экстраполировать на степень выраженности репаративного процесса слизистой (табл. 2), сравнить и установить достоверность происходимого процесса репарации и выявить степень и характеристики устойчивости ответной реакции организма по взаимосвязи с уровнем иммуномодулирующей реакции. Табл. 2 полностью отражает клиническую картину регенерации и позволяет установить прогноз качества проводимой терапии у пациентов вне зависимости от возрастной и половой характеристики пациентов.

Используя данные табл. 3, возможно оценить степень выраженности репаративного процесса слизистой оболочки носовых ходов при лечении любым местным иммуномодулирующим препаратом (или препаратом другой лекарственной группы) и тем самым уже на предварительном этапе оценить прогноз сроков «выздоровления» пациентов.

Обсуждение результатов

При анализе литературных данных [2, 4, 6, 7] выявлено, что применение Гриппферона не сокращало сроков длительности купирования назофарингеального синдрома ОРВИ по сравнению с нашими полученными результатами при использовании Деринат®, 0,25%-го раствора, а лечение человеческим жидким интерфероном вообще увеличивало сроки купирования на 30% (табл. 3).

Уровень иммунного ответа был выше на 35% при применении Дерината в сравнении с данными литературы по Гриппферону и Интерферону лейкоцитарному человеческому. При этом по последнему препарату репарация на 7-е сутки полностью отсутствовала, тогда как на лечении Деринатом она была активной по степени напряженности и стремилась к состоянию «полного здоровья» (табл. 2 и 3).

Выводы

1. Острые респираторные инфекции у детей приводят к снижению репаративных свойств эпителиоцитов слизистой, связанных с уровнем местного иммунного ответа. Корреляционные связи показали, что снижение уровня секреторного иммуноглобулина А достоверно приводит к разрушению слизистой и снижению ответной иммунной реакции на внешнего возбудителя.
2. Применение препарата Деринат®, раствор для наружного и местного применения 0,25% вызывает рост местной иммунной защиты, связанный с повышением уровня секреторного иммуноглобулина, который достоверно коррелирует со средним показателем деструкции клеток, вызывая его снижение. На фоне такой динамики индекса происходит обновление эпителиоцитов, появляются «юные» клетки (1–2 класс деструкции), которые способствуют заживлению пораженных участков и формированию надежной местной иммунной защиты. Все это свидетельствует о том, что Деринат® обладает высокими репаративными характеристиками уже на 1–2 сутки терапии назофарингеального синдрома ОРВИ.
3. Патогенная микрофлора уменьшает колонии роста 7 дней после применения препарата Деринат®, раствор 0,25%.
4. Коэффициент репарации слизистой верхних дыхательных путей, вычисляющейся по формуле, созданной по результатам репаративного эффекта препарата Деринат®, является уникальным критерием оценки перспективы иммунозащитных свойств слизистой оболочки, который может экстраполироваться на местное применение любого лекарственного препарата.

Литература

1. Черешнев В. А., Юшков Б. Г., Данилова И. Г., Черешнева М. В., Храмцова Ю. С., Чиши М. А., Арташян О. С. Влияние полиоксидония и тамерита на регенераторные процессы в тканях с различной восстановительной способностью // Иммунология. 2005, т. 26, № 4, с. 199–201.
2. Лядов Д. В., Зуйкова А. А., Красноруцкая О. Н., Бугримов Д. Ю. Сравнительная оценка и методологическое обоснование профилактики ОРВИ в детских организованных коллективах // Вестник новых медицинских технологий. 2012, т. 19, № 2, с. 299–301.
3. Оценка основных критериев заболеваемости детей в организованных коллективах на фоне применения иммуномодулирующих средств. Сб. трудов конференции «Современный взгляд на будущее науки», Уфа, 2014. С. 78–84.
4. Филатов О. Ю., Кашаева О. В., Бугримов Д. Ю., Климович А. А. Морфофизиологические принципы иммунологического действия ДНК эукариот // Российский иммунологический журнал. 2013, т. 7 (16), № 4.
5. Brown S. L., Riehl Т. Е., Walker M. R., Geske M. J., Doherty J. M., Stenson W. F., Stappenbeck T. S. //J. Clin. Invest. 2007, 117, 258–269.
6. Pevsner-Fischer M., Morad V, Cohen-Sfady M., Rousso-Noori L., Zanin-Zhorov A., Cohen S., Cohen I. R., Zipori D. Blood. 2007, 109, 1422–1432.
7. Bennett A. L., Smith D. W., Cummins M. J., Jacoby P. A., Cummins J. M., Beilharz M. W. Low-dose oral interferon alpha as prophylaxis against viral respiratory illness: a double-blind, parallel controlled trial during an influenza pandemic year // Influenza Other Respir Viruses. 2013, 7 (5), 854–862. doi: 10.1111/irv.12094. Epub 2013 Feb 9.

---

Е. А. Балакирева*, доктор медицинских наук
Д. Ю. Бугримов*^{, 1}, кандидат медицинских наук
О. Ю. Филатов**, доктор медицинских наук, профессор
О. В. Кашаева**, кандидат медицинских наук
В. А. Назаров**, кандидат биологических наук

* ГБОУ ВПО ВГМА им. Н. Н. Бурденко МЗ РФ, Воронеж
** ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова Минздрава РФ, Москва

¹ Контактная информация: danikst@mail.ru