Оптимизация диагностических подходов в тактике ведения больных гриппом

Грипп занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии человека. Во всех странах мира основной экономический ущерб от инфекционных заболеваний наносят именно грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). В России на их долю приходится примерно 90% всей регистрируемой инфекционной заболеваемости. По данным официальной статистики в РФ ежегодно регистрируется от 900 тысяч до 3,5 млн случаев гриппа, при этом умирает от 20 до 53 тысяч человек в год [1].

Заболеваемость гриппом существенно колеблется в разное время года, увеличиваясь, как правило, в осенне-зимнее время. Тем не менее, случаи гриппа могут регистрироваться даже в межэпидемический период. История изучения гриппа уходит своими корнями еще в средние века. Первая эпидемия, о которой мы знаем, имела место в 1889–1890 гг. и была вызвана подтипом вируса гриппа А (H2N8) [2]. Благодаря уникальным свойствам вируса гриппа А и прежде всего его способности к изменению антигенной структуры, специфический иммунитет, приобретенный после перенесенного заболевания, практически не защищает от инфицирования новым штаммом вируса гриппа. Во время ежегодных вспышек и эпидемий гриппа и других ОРВИ заболевает каждый 10-й взрослый и каждый 3-й ребенок [3]. По данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий, вызванных различными вирусами гриппа, в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тысяч (большинство из них в возрасте старше 65 лет), причем в некоторые годы число смертей может достигать миллиона [4]. Пандемии гриппа возникают каждые 30–40 лет и характеризуются высокими показателями заболеваемости и смертности [5].

В настоящее время существуют различные противовирусные препараты для лечения гриппа. Их можно разделить на три группы: этиотропные — ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занамивир, перамивир), блокатор ионного канала, образованного белком М2 (Ремантадин, Альгирем), ингибиторы NP-белка (Ингавирин), ингибитор гемагглютинина (Арбидол); препараты интерферона (рекомбинантные альфа/гамма-интерфероны); индукторы интерферонов (Кагоцел, Амиксин, Циклоферон). Наиболее эффективна противовирусная терапия, начатая в первые 24–48 часов от начала заболевания, которая позволяет существенно сократить продолжительность лихорадки и других клинических симптомов заболевания [6].

Именно поэтому необходимость точной и своевременной диагностики гриппа не вызывает сомнений. На сегодняшний день в клинической практике чаще всего используется метод прямой иммунофлуоресценции (ИФ) и, намного реже, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Как известно, метод ИФ предложил А. Кунс еще в 1941 г. Реакция ИФ основана на связывании антигена с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, флюоресцеина изотиоционатом (FITС), тетраметилродамин изотиоционатом (TRITC) и др.). Сегодня для проведения этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны [7].

Метод ПЦР был разработан сотрудником фирмы Cetus K. Mullis в 1983 г. Существуют различные модификации этой реакции. В настоящее время используют ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР), суть которой заключается в амплификации определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов [8, 9].

Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу диагностического значения методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР с целью оптимизации диагностических подходов в тактике ведения больных острыми респираторными заболеваниями и гриппом.

Материалы и методы

Всего в исследование включен 81 мужчина и 59 женщин (140 пациентов), поступавших в отделения острых респираторных вирусных инфекций ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы в состоянии средней тяжести с направительным диагнозом: «ОРВИ» либо «Грипп». Средний возраст больных — 35,5 ± 1,6 года (от 15 до 87 лет). Критериями включения пациентов в исследование были: наличие симптомов гриппа и ОРВИ (повышение температуры тела, симптомы интоксикации и катарального воспаления дыхательных путей); обследование двумя методами для подтверждения гриппа (прямая ИФ и ПЦР) в первые двое суток от момента поступления больного в стационар. При этом материал, взятый от больного для проведения этих исследований, должен был содержать достаточное количество клеток эпителия носоглотки для анализа. Критериями исключения из исследования были: наличие хронической обструктивной болезни легких, беременность.

Всем пациентам, включенным в исследование, проводилось стандартное общеклиническое обследование: сбор анамнеза заболевания, объективный осмотр, анализ клинической картины в сопоставлении с данными лабораторно-инструментальных методов исследования (общие анализы крови и мочи, рентгенологическое исследование органов грудной клетки). Для оценки степени дыхательной недостаточности больным проводилась пульсоксиметрия. При наличии у пациента пневмонии по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки дополнительно назначался биохимический анализ крови (определение уровней аланин­аминотрансферазы (АлАТ), аспартат­аминотрансферазы (АсАТ), мочевины, креатинина, креатининфосфокиназы), а также анализ крови для оценки кислотно-основного состояния и электролитов.

Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось при помощи ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для выявления генетического материала вирусов гриппа А (сезонного), гриппа А (H1N1) pdm09, гриппа В в эпителии носоглотки/ротоглотки при помощи тест-систем «АмплиСенс®» с аналитической чувствительностью — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.

Иммунологическое исследование выполнялось при помощи метода прямой ИФ. Диагностикум представляет собой специфические моноклональные антитела (иммуноглобулины), меченые флуоресцеинизотиоцианатом. В работе использовались серии диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г. Санкт-Петербург), рабочее разведение диагностикумов было не ниже 1:16. Анализ мазков-отпечатков из носоглотки проводился с помощью люминесцентного микроскопа «Биомед-6» (Россия).

Результаты

Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа больных (n = 140), в которой были применены одновременно эти две методики с целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на три подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты, у которых диагностика гриппа двумя методиками проводились в один день; 2-я подгруппа — пациенты, которым ПЦР было выполнено раньше метода ИФ на 1–2 суток; 3-я подгруппа — пациенты, которым метод прямой ИФ был проведен раньше ПЦР на 1–2 суток. Результаты исследования эпителия носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование, представлены в табл. 1–3.

Выполнено сравнение частоты регистрации четырех комбинаций (профилей) результатов тестов прямой ИФ и ОТ-ПЦР: ИФ«+»/ПЦР«+», ИФ«-»/ПЦР«+», ИФ«+»/ПЦР«-», ИФ«-»/ПЦР«-».

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0005 и p = 0,0019 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 37), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой, но достоверно отличалась только от частоты выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0078), в то время как достоверной разницы с частотой выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«+» не выявлено (p = 0,0868).

Как видно из табл. 1, в группе больных (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%) пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то время как в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа выявить не удалось.

В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.

В группе больных (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым исследование ОТ-ПЦР было выполнено на 1–2 дня раньше прямой ИФ и в 1–3 дня от начала болезни, грипп был подтвержден у 9 пациентов, и только методом ОТ-ПЦР в 100% случаев (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 40), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0006 и p = 0,0002 соответственно).

Как видно из табл. 2, в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 1–3 сутки от начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не удалось ни у одного пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.

В группе больных (n = 39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от момента заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом большинство положительных результатов (90%, 27/30) получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.

В группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, грипп лабораторно подтвержден тем или иным методом у 77,8% (14/17) больных, при этом большинство положительных результатов также было получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 14,3% (2/14) случаев.

В табл. 3 представлены результаты пациентов, у которых исследование методом прямой ИФ было сделано раньше ОТ-ПЦР и обследованных позже 3-го дня болезни. Из трех пациентов, обследованных на 4-й день и позже, грипп был подтвержден в 100% случаев только методом ОТ-ПЦР (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).

В целом, среди всех обследованных, независимо от дня болезни, на который выполнялось исследование, были пациенты (n = 10), у которых при помощи метода прямой ИФ выявлялись антигены вируса гриппа, в то время как методом ОТ-ПЦР выделить генетический материал вируса не удавалось (профиль ИФ«+»/ПЦР«-»). Такое расхождение результатов обследования наблюдалось в 7,1–17,6% случаев, не прослеживалось связи указанного профиля с днем болезни, на который проводилось обследование, однако в группе больных, у которых обследование методом прямой ИФ применялось раньше ОТ-ПЦР, таких пациентов не было.

Обсуждение

Среди всех больных с диагностированным гриппом доля положительных результатов ОТ-ПЦР-исследования составляет от 77,8% до 100%. При этом основную группу (78,9%, 90/114) составили пациенты, у которых методом ОТ-ПЦР был выявлен генетический материал вируса гриппа, в то время как антигены вируса гриппа при проведении прямой ИФ идентифицировать не удавалось. Доля лабораторно-подтвержденных случаев гриппа методом прямой ИФ (среди всех подтвержденных случаев как методом прямой ИФ, так и ОТ-ПЦР) составила 21,1%. Полученные результаты свидетельствуют о больших диагностических возможностях метода ОТ-ПЦР у больных гриппом, и что немаловажно, независимо от дня болезни при наличии клинической картины острого заболевания.

Меньшие диагностические возможности метода прямой ИФ объясняются самим механизмом реакции. Антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело [7]. Достоинством метода ОТ-ПЦР является необязательность условия наличия большого количества возбудителя в клетках эпителия, так как сам метод предусматривает увеличение количества копий ДНК/РНК возбудителя (амплификация) с последующей его детекцией [8, 9]. Так как оба метода используются преимущественно для ранней диагностики гриппа, что принципиально для своевременного назначения противовирусной терапии, то, безусловно, клиницист отдаст свое предпочтение тому методу, который позволяет это сделать с наибольшей вероятностью.

Также необходимо учитывать, что большая разница в частоте лабораторного подтверждения гриппа, свидетельствующая о низкой диагностической возможности метода прямой ИФ, может быть объяснена вероятностью перекрестных реакций, быстрым разрушением флуоресцентной метки, субъективностью оценки результатов реакции. Последний фактор зависит непосредственно от квалификации врача-лаборанта, проводящего исследование. Помимо этого проведение прямой ИФ — весьма трудоемкий неавтоматизированный процесс, требующий больших временных затрат от специалиста. По сравнению с методом прямой ИФ ОТ-ПЦР является автоматизированным высокочувствительным методом, дающим возможность выявлять даже единичные копии ДНК/РНК возбудителя на поздних сроках от начала заболевания. ОТ-ПЦР обладает высокой специфичностью, что обусловлено определением участка гена, характерного только для данного возбудителя.

Выводы

1. Для ранней диагностики гриппа большую диагностическую ценность демонстрирует метод ОТ-ПЦР по сравнению с методом прямой ИФ.
2. Для оптимизации лечебной тактики ведения больных c гриппом целесо­образно широкое внедрение метода ОТ-ПЦР в клиническую практику.
3. Оптимальные сроки обследования — первые 5 дней болезни, однако при наличии клинической симптоматики гриппа метод ОТ-ПЦР информативен и на более поздних сроках заболевания.

Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (протокол № 1 от 19 марта 2010 г.) по соглашению № 16.120.11.5354-НШ от 01.02.2012 г.

Литература

1. Салтыкова Т. С. Заболеваемость гриппом и отсроченная смертность у лиц старше 60 лет. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2010.
2. http://www.epidemiolog.ru/all_of_diseases/detail.php? ID = 2002901.
3. http://www.omnipharm.ru/articles/71/page/17/.
4. http://www.who.int/ru.
5. Климова Е. А., Ющук Н. Д., Кареткина Г. Н. и др. Исходы тяжелого течения пандемического гриппа А/H1N1/2009 // Терапевтический архив. 2010. № 11, с. 15–18.
6. Петров В. И., Ленева И. А., Недогода С. В. Применение отечественного противовирусного препарата с позиций доказательной медицины // Лечащий Врач. 2011. № 1, с. 71–79.
7. http://www.biovitrum.ru/presscenter/articles/razdel1/podrazdel2/istoriya_immunogistohimii.
8. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. Методическое пособие. «НПФ ДНК-технология». М., 1998. http://www.twirpx.com/file/454057/.
9. Heid C. A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 1996. № 6, p. 986–994.
10. Екимов А. Н., Шипулин Г. А., Бочкарев Е. Г., Рюмин Д. В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) // http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm.

*ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова Минздравсоцразвития России,
**ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения города, Москва

Контактная информация об авторах для переписки: pavo@mail.ru