Повышение результативности использования комплексных патоморфологических исследований для своевременной диагностики грибовидного микоза

15-05-2020
За период 2010–2019 гг. проведены патоморфологические исследования биоптатов кожи у 561 больного с подозрением на лимфопролиферативные заболевания кожи, верифицирован диагноз первичных лимфом кожи у 105 больных, из них грибовидный микоз выявлен у 86 больн

Первичные лимфомы кожи (ПЛК), ранее именовавшиеся злокачественными лимфомами кожи, представляют собой большую гетерогенную группу лимфопролиферативных заболеваний кожи (ЛПЗК), развитие которых обусловлено неопластической пролиферацией в коже клонов Т-лимфоцитов, NK-клеток или В-лимфоцитов, и характеризующуюся не­уклонно прогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом [1–5].

Грибовидный микоз (ГМ) является наиболее распространенной формой Т-клеточных ПЛК. При классическом варианте ГМ заболевание протекает стадийно с последовательным развитием клинических фаз: пятнистой (эритематозной), бляшечной и опухолевой. Заболевание начинается с розовато-буроватых, неярких пятен разных размеров, с четкими границами, которые расположены несимметрично и чаще локализуются на участках кожи, защищенных от солнечного воздействия. Для бляшечной стадии характерно образование инфильтрированных бляшек различной величины и плотности, желтовато-красной или синюшной окраски. Поверхность их может быть гладкой, слегка шелушащейся или лихенифицированной. Разрешаются бляшки медленно и неравномерно, при разрешении в центре приобретают кольцевидную форму. В опухолевой стадии у больного обычно обнаруживается сочетание пятен, бляшек и опухолевых узлов. Узлы могут формироваться как в области существующих бляшек, так и на непораженной ранее коже. Большинством авторов признается сложность клинической дифференциальной диагностики ранних стадий ПЛК, имитирующих широкий спектр хронических дерматозов (ХД), что делает возможным постановку клинического диагноза ПЛК не более чем у 25–33% больных. Наиболее часто врачу-дерматовенерологу при первичном обращении больного приходится проводить клиническую дифференциальную диагностику ГМ и доброкачественных воспалительных дерматозов: парапсориаз, хроническая экзема, псориаз, атопический дерматит, взрослая фаза, диффузный тип [6–10].

Известно, что «золотым стандартом» диагностики ГМ является клиническое обследование с картированием очагов поражения, биопсия кожи с патоморфологическими и иммуногистохимическими (ИГХ) исследованиями, при возможности – определение перестройки гена Т-клеточного рецептора. ГМ характеризуется следующими основными патоморфологическими признаками: формированием эпидермотропного инфильтрата, состоящего преимущественно из Т-лимфоцитов малого и среднего размера, выраженность которого варьирует в зависимости от стадии заболевания; деструктивными изменениями в эпидермисе с нарушением целостности дермоэпидермального соединения и проникновением лимфоцитов в базальный слой, диффузным распространением в шиповатом слое, формированием микроабсцессов Потрие [11, 12].

В основе ИГХ-исследований тканей (биоптата) лежит реакция антиген–антитело, что позволяет выявлять и определять точную локализацию того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) в тканях in situ с помощью ИГХ-реакций. Спектр моноклональных антител (МКА), принятый в диагностике ПЛК в соответствии с Федеральными клиническими рекомендациями по дерматовенерологии (2016 г.): CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20, CD30 [11]. Однако, по данным научных исследований, дополнительную информацию о свойствах дермального инфильтрата при ПЛК дают и другие иммуномаркеры, такие как CD1а — для выявления клеток Лангерганса, а также Ki67 — для оценки пролиферативной активности клеток в составе инфильтратов, что было использовано нами дополнительно к основной панели МКА [5, 12].

Даже при реализации «золотого стандарта» диагностики существуют трудности в интерпретации результатов патоморфологических и ИГХ-исследований биоптатов кожи при дифференциальной диагностике ПЛК и ХД [12–14]. Большинство патоморфологических исследований в области дерматоонкологии выполнено с использованием полуколичественной оценки с применением критериев «отрицательная/положительная реакция», при этом степень выраженности обозначается знаками «+» (от 1 до 4), что не исключает доли субъективизма. На современном этапе в диагностике различных заболеваний все большее значение приобретает использование количественной оценки патоморфологических и ИГХ-характеристик биоптата. С целью объективизации процесса диагностики дополнительной опцией может служить разработка новых диагностических технологий и экспертных систем квантифицированной (с измерением качественных признаков в количественном выражении) оценки результатов патоморфологических и ИГХ-исследований у больных ПЛК [15–19].

Выполнение таких морфометрических исследований требует обязательной стандартизации условий при изготовлении гистологических препаратов, что наилучшим образом достигается использованием современного оборудования, позволяющего выполнять необходимые операции по обработке материала в автоматическом режиме [19]. Комплексное использование современного гистологического оборудования и специализированного программного обеспечения для морфометрии позволяет объективизировать процесс диагностики, повысить ее эффективность при выявлении ПЛК.

На основании анализа результатов количественной оценки объемной доли (ОД) позитивности ИГХ-маркеров лимфоцитов инфильтрата дермы, их субпопуляционного состава и индекса пролиферации (Ki67+) нами разработаны модели предварительной дифференциальной диагностики ГМ и ХД, а также ранних и поздних стадий ГМ, реализуемые с помощью программ для ЭВМ [20–22].

Целью данного ретроспективного исследования является обобщение и анализ результатов комплексных подходов к диагностике ПЛК в ГБУ СО УрНИИДВиИ за период 2010–2019 гг. с использованием методов светооптической микроскопии, иммунофенотипирования и морфометрии, посредством изучения основных качественных и количественных характеристик дермального инфильтрата, формирующегося при различных стадиях ГМ.

Материалы и методы исследования

Проанализированы результаты комплексной диагностики ПЛК в ГБУ СО УрНИИДВиИ за период 2010–2019 гг. Количество обследованных больных с подозрением на ЛПЗК с использованием клинического и гистологического методов — 561, что составило 15,22% от всех проведенных патоморфологических исследований, на основе которых ИГХ-исследования рекомендованы в 225 случаях, выполнено ИФТ — в 146 случаях.

Для постановки диагноза была необходимость выполнения как стандартных патоморфологических исследований, так и использования специальных методов, в частности, ИФТ с целью определения фенотипа лимфоцитов, формирующих инфильтраты в дерме, их количественных параметров (морфометрия) в каждом наблюдении, а также выявления соотношения между наиболее значимыми для дифференциальной диагностики характеристиками лимфоцитов.

Патоморфологические исследования выполнены на светооптическом уровне с использованием исследовательских микроскопов производства LEICA и ZEISS (Германия). Первичные исследования производили с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином-эозином. В случаях неясного диагноза с целью верификации рекомендовали выполнение ИФТ, показаниями для использования которого являлось обнаружение патоморфологических признаков, характеризующих различные стадии ГМ [11].

ИФТ выполнялось в автоматизированном режиме с использованием иммуногистостейнера Bond-MaX (Германия), МКА производства Leica biosystems Newcastle Ltd (Соединенное Королевство): CD1a (MTB1), CD2 (11F11), CD3 (LN10), CD4 (4B12), CD5 (4C7), CD7 (LP15), CD8 (4B11), CD20 (MJ1), CD30 (1G12), Ki67 (MM1) и необходимых реагентов для постановки ИГХ-реакций. В целях более полной оценки иммунофенотипа лимфоцитов, функциональных потенций клеток кожи и формируемого пролиферата нами использована также методика двойного ИФТ, которая дает возможность визуализации в одном поле зрения интересующих объектов, окрашенных различными цветами. Подбор иммуномаркеров для двойного ИФТ осуществлялся в зависимости от цели исследования.

Для морфометрических исследований использованы программы ZEN 2012 (Германия) — для ввода изображений гистологических препаратов и SIAMS (Россия) — для дальнейшей обработки оцифрованных изображений. При выполнении морфометрических исследований использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, окрашенные методом ИФТ. В каждом наблюдении анализировали по 5 имиджей, содержащих участки дермального инфильтрата с наибольшей плотностью. Изучаемые показатели: общая площадь исследуемого имиджа, содержащего дермальный инфильтрат; суммарная площадь в нем иммунофенотипированных клеток; их доля (ОД) в составе анализируемого имиджа.

Результаты исследования

В клинике ГБУ СО УрНИИДВиИ за период 2010–2019 гг. под наблюдением находился 561 больной с подозрением на ПЛК (от 24 до 73 больных ежегодно). После проведения этапа клинической и патоморфологической диагностики диагноз ПЛК был верифицирован у каждого пятого пациента — 105 больных (18,7%), при этом у подавляющего большинства установлен диагноз ГМ — 86 больных (81,9%). В большинстве случаев диагностирована II стадия ГМ — 59 больных (68,6%). У 21 больного (24,4%) выявлено наличие I стадии ГМ, у 6 больных (7,0%) диагностирована III (опухолевая) стадия.

Для верификации диагноза ПЛК ИГХ-исследования биопсийного материала в различные годы изученного периода были рекомендованы от 13 до 35 больным (23,3–60,9%), количество выполненных ИФТ варьировало более существенно — от 4 до 21 случая (23,5–100%). Диагностирование ПЛК ежегодно, на основе проведенных ИГХ-исследований, составило от 4 до 18 случаев (41,6–100%), при этом верификация ГМ от количества подтвержденных ПЛК составила от 3 до 17 случаев (75–100%).

Наиболее важная составляющая патоморфологической диагностики ГМ — характеристика дермального инфильтрата. При этом помимо локализации, распространенности, плотности инфильтрата очень значима его качественная характеристика: определение клеточного состава, выявление иммунофенотипа опухолевых клеток, наличие клонального опухолевого роста.

При патоморфологических исследованиях для I стадии ГМ было характерно обнаружение в отдельных участках сосочкового слоя дермы рыхлого мелкофокусного периваскулярного лимфогистиоцитарного инфильтрата с очаговым эпидермотропизмом. В отдельных случаях можно было наблюдать расположение лимфоцитов разрозненно или цепочкой в базальном слое, единичные некрупные микроабсцессы Потрие.

На II стадии ГМ визуализировались более специфичные для данного заболевания признаки: наличие в верхних слоях дермы плотного полосовидного или диффузно-очагового эпидермотропного лимфогистиоцитарного инфильтрата, в котором обнаруживались крупные клетки с гипер­хромными, иногда церибриформными ядрами. В эпидермисе нередко выявлялись некрупные микроабсцессы Потрие и/или лимфоциты, окруженные светлым перинуклеарным ободком (haloed lymphocytes).

Для III (опухолевой) стадии ГМ характерно наличие массивного инфильтрата из лимфоидных клеток, вариабельных по форме и размерам, отсутствие в отдельных участках эпидермотропизма и дермоэпидермальной границы, выраженные деструктивные изменения в эпидермисе с формированием в нем микроабсцессов Потрие различных размеров.

Полученные данные ИФТ с использованием МКА CD3, CD4, CD8, Ki67 позволили получить объективную картину участия в процессе формирования дермального инфильтрата Т-лимфоцитов в целом, субпопуляций хелперов и супрессоров, выявить особенности течения пролиферативного процесса. На ранних стадиях заболевания в составе дермального инфильтрата выявлялось умеренное количество Т-лимфоцитов, на поздних стадиях наблюдалось значительное количество данных клеток в составе сформированного объемного инфильтрата, распространяющегося в нижележащие участки дермы (рис. 1, А–В). Визуально на представленных имиджах наиболее плотное и равномерное расположение хелперов (CD4+) в составе дермальных инфильтратов определяется на II стадии ГМ (рис. 1, Б).

Выполнение морфометрических исследований позволило определить количественные параметры представительства лимфоцитов в составе инфильтратов на различных стадиях заболевания. Так, средние значения ОД CD4+ у данных больных составили: I стадия — 0,86 ± 0,033 (рис. 1, А), II стадия — 0,302 ± 0,143 (рис. 1, Б), III стадия — 0,227 ± 0,028 (рис. 1, В). Минимальные значения CD4+ выявлены в начале заболевания (стадия пятна), при формировании бляшек прослеживается максимальное увеличение их количества с последующим уменьшением в опухолевой стадии. Учитывая, что при диагностировании ГМ на различных стадиях значение соотношения CD4/CD8 является одним из определяющих критериев, особенно важно получение количественных критериев позитивности данных клеток.

В целях более полной оценки иммунофенотипа ПЛК, наличия и соотношения лимфоцитов в эпидермисе и дерме, функциональных потенций клеток кожи и пролиферата целесообразно использование методики двойного ИГХ-окрашивания, которая дает возможность визуализации в одном поле зрения двух интересующих объектов, окрашенных различными цветами (рис. 2).

Особенно значимой при определении различных стадий ГМ является одновременное наблюдение пролиферирующих клеток (Ki67+) в сочетании с выявлением лимфоцитов определенного фенотипа, в частности, Т-хелперов CD4+ в составе микроабсцесса Потрие (рис. 2, А). Также несомненным достоинством использования данного метода является возможность наблюдения в одном поле зрения прогностически значимых компонентов дермального инфильтрата, в частности, определение представительства в его составе хелперов (CD4+) и супрессоров (CD8+), визуализация их соотношения (рис. 2, Б).

Анализ биопсийного материала, поступившего на патоморфологическое исследование за период работы данного подразделения в ГБУ СО УрНИИДВиИ (2010–2019 гг.), показал существенные различия по изученным параметрам в промежутках 2010–2013 гг. и 2014–2019 гг., характеризующиеся минимальными значениями в периоде до 2014 г. и их увеличением в 3–4 раза в последующем, что обусловлено появлением возможности выполнения ИФТ непосредственно в ГБУ СО УрНИИДВиИ (рис. 3).

ГМ был диагностирован у половины больных в возрасте 58–75 лет, в то же время у 30% больных данное заболевание впервые было верифицировано в возрасте от 19 до 50 лет. Так, ГМ II стадии был выявлен у больного 19 лет (фолликулотропный вариант) и у двух больных в возрасте 34 лет (классический вариант), ГМ III стадии — у боль­ного 49 лет.

Необходимо отметить, что внедрение новых технологий патоморфологической диагностики увеличило долю больных ГМ, выявленных на ранних стадиях заболевания. В 2018 г. количество больных с I стадией составило 29,4% от выявленных случаев и 50,0% — от всех диагностированных за 9-летний период. В 2019 г. выявлено 11 больных с ранними стадиями ГМ (I–IIA), что составило 64,7% от диаг­ностированных случаев ГМ за год, превысив суммарный показатель (10 больных) за 2010–2018 гг. (рис. 4).

О результативности использования собственных ресурсов для ИГХ-исследований свидетельствует сравнительная характеристика основных показателей диагностики в отдельные годы (табл.). Так, при равном или сопоставимом количестве больных с подозрением на ПЛК получены различающиеся значения по изучаемым показателям в различные временные промежутки: до использования метода ИФТ в нашем учреждении (2010–2013 гг.), в период освоения (2013–2014 гг.) и его эффективной реализации (2015–2019 гг.).

Анализ материала, полученного в нашем учреждении за 2019 г., подтверждает тенденцию к более раннему выявлению ГМ при условии выполнения комплексных патоморфологических исследований, с полноценным использованием современного оборудования, методов ИФТ и морфометрии.

Так, за 2019 г. ГМ на ранних стадиях (I–IIА) выявлен у большинства обследованных больных с использованием метода ИФТ: 11 случаев из 17; только у трети больных диагностирован ГМ IIА стадии (всего 6 случаев: 5 больных — классический вариант, у 1 больного — фолликулотропный вариант ГМ). Помимо этого, в 2 случаях диагностирован хронический дерматоз, у 1 больного выявлена доброкачественная лимфоплазия кожи, в 1 случае обнаружен подтип первично кожной периферической Т-клеточной лимфомы с индолентным течением.

При проведении ИФТ вне нашего учреждения за первые 3 года работы патоморфологического подразделения (2010–2012 гг.) выявлено всего 3 случая ГМ I стадии, тогда как за последние 3 года (2017–2019 гг.) с появлением возможности полноценно выполнять ИГХ и морфометрические исследования в ГБУ СО УрНИИДВиИ диагностировано 17 случаев.

Положительная динамика выявления ГМ на ранних стадиях (2017 г. — 1 случай, 2018 г. — 5 случаев, 2019 г. — 11 случаев) является убедительным доказательством востребованности, эффективности и полноценного комплексного использования современных патоморфологических методов, включающих ИГХ-исследования, в учреждениях дерматовенерологического профиля.

Заключение

Проведенный ретроспективный анализ свидетельствует о большой востребованности патоморфологических и ИГХ-исследований для установления диагноза ПЛК среди больных хроническими дерматозами, из числа которых ежегодно клинически было заподозрено наличие ПЛК у 24–73 пациентов.

Опыт применения метода ИФТ в клинической повседневной практике ГБУ СО УрНИИДВиИ показывает его значимость как для эффективной диагностики ПЛК, так и для дифференциальной диагностики заболеваний у больных «со сложным диагностическим поиском». Несомненным преимуществом в улучшении процесса диагностики является возможность использования современного оборудования, квантифицированной оценки субпопуляций лимфоцитов в составе дермального инфильтрата. Комплексное использование патоморфологических, иммуногистохимических и количественных морфометрических исследований позволяет объективизировать процесс диагностики, повысить ее результативность, в том числе по выявлению ранних стадий ГМ.

Литература

  1. Ahn C. S., ALSayyah A., Sangüeza O. P. Mycosis fungoides: an update review of clinicopathologic variants // American Journal of Dermatopathology. 2014. Т. 36. Р. 933–948.
  2. Дерматоонкология (злокачественные новообразования кожи, первичные лимфомы кожи): атлас / Под общ. ред. проф. Н. В. Кунгурова. Екатеринбург: Издательско-полиграфическое предприятие «Макс-Инфо», 2016. 168 с.
  3. Воронцова А. А., Карамова А. Э., Знаменская Л. Ф. Современные представления о патогенезе грибовидного микоза // Онкогематология. 2018. Т. 13. № 3. С. 39–46.
  4. Kelati A., Gallouj S., Tahiri L. et al. Defining the mimics and clinico-histological diagnosis criteria for mycosis fungoides to minimize misdiagnosis // International Journal Womens Dermatology. 2017. Vol. 3 (2). P. 100–106.
  5. Willemze R., Cerroni L., Kempf W. et al. The 2018 update of the WHO-EORTC classification for primary cutaneous lymphomas // Blood. 2019. Vol. 133 (16). P. 1703–1714.
  6. Trautinger F., Eder J., Assaf C. еt al. European Organisation for Research and Treatment of Cancer consensuns reconnendations for the treatment of mycosis fungoides / Sezary syndrome e Update 2017 // European Journal of Cancer. 2017. Т. 77. Р. 57–74.
  7. Felcht M., Hillen U., Klemke C. D. Diagnostics of primary cutaneous lymphomas // Hautarzt. 2017. Т. 68 (9). Р. 696–701. DOI: 10.1007/s00105-017-4020-6.
  8. Basir H. R. G., Alirezaei P., Rezanejad A. et al. Early morphea simulating patch-stage mycosis fungoides in two cases // Dermatology Reports. 2018. Т. 10 (1). Р. 7471. DOI: 10.4081/dr.2018.7477.
  9. Belousova I. E., Khairutdinov V. R., Bessalova A. et al. Mycosis fungoides manifesting as giant cell lichenoid dermatitis // American Journal of Dermatopathology. 2018. Т. 40 (4). Р. 283–285.
  10. Aun J. A., Patel H. S., Patel K. K. et al. Perplexing Rash: Challenges to Diagnosis and Management of Mycosis Fungoides // Journal of the American Osteopathic Association. 2018. Т. 118 (7). Р. 472–478. DOI: 10.7556/jaoa.2018.101.
  11. Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. 5-е изд., перераб. и доп. М.: Деловой экспресс, 2016. 768 с.
  12. Белоусова И. Э., Казаков Д. В., Криволапов Ю. А. Современные подходы к диагностике и лечению первичных лимфом кожи на основе новой ВОЗ-EORTC классификации. Т-клеточные лимфомы кожи // Архив патологии. 2007. № 69 (5). С. 11–17.
  13. Amorim G. M., Niemeyer-Corbellini J. P., Quintella D. C. et al. Clinical and epidemiological profile of patients with early stage mycosis fungoides // Anais Brasileiros De Dermatologia. 2018. Т. 93 (4). Р. 546–552.
  14. Олисова О. Ю., Грекова Е. В., Варшавский В. А. и соавт. Современные возможности дифференциальной диагностики бляшечного парапсориаза и ранних стадий грибовидного микоза // Архив патологии. 2019. Т. 81 (1). С. 9–17.
  15. Сыдиков А. А., Заславский Д. В., Зайцев В. С. и др. Иммуно­гисто­хими­ческие критерии диагностики мелкобляшечного парапсориаза, крупнобляшечного парапсориаза и грибовидного микоза // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6. С. 568–575.
  16. Жуков А. С., Белоусова И. Э., Самцов А. В. Роль иммуногистохимического метода в диагностике грибовидного микоза // Вестник дерматологии и венерологии. 2014. № 2. С 38–46.
  17. Mancebo S. E., Cordova M., Myskowski P. L. et al. Reflectance confocal microscopy features of mycosis fungoides and Sézary syndrome: correlation with histopathologic and T-cell receptor rearrangement studies // Journal of Cutaneous Pathology. 2016. Т. 43 (6). Р. 505–515.
  18. Geller S., Myskowski P. L., Pulitzer M. et al. Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), rare subtypes: five case presentations and review of the literature // Chinese Journal of Clinical Oncology. 2019. Т. 8 (1). DOI: 10.21037/cco.2018.11.01 [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://cco.amegroups.com/article/view/22497 (дата обращения: 20.03.2020).
  19. Сафонова Г. Д., Кохан М. М., Зильберберг Н. В., Римар О. Г., Куклин И. А. Оптимизация диагностики и перспективы патогенетических исследований первичных лимфом кожи (обзор литературы) // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2014. № 12-2. С. 264–268.
  20. Куклин И. А., Кохан М. М., Сафонова Г. Д., Торопова Н. П., Кузнецов И. Д. Грибовидный микоз: совершенствование диагностики ранних и поздних стадий с помощью квантифицированной оценки результатов иммуногистохимического исследования биоптата кожи // Лечащий Врач. 2018. № 11. С. 15–19.
  21. Кунгуров Н. В., Куклин И. А., Кохан М. М., Сафонова Г. Д. Способ определения стадии грибовидного микоза // Патент 2660542 Российская Федерация, МПК G01N 33/53; № 2017138188; заявл. 04.10.2017; опубл. 06.07.2018, Бюл. № 19.

Н. В. Кунгуров, доктор медицинских наук, профессор
Г. Д. Сафонова1, кандидат биологических наук
М. М. Кохан, доктор медицинских наук, профессор
О. Г. Римар
И. А. Куклин,
кандидат медицинских наук

ГБУ СО УрНИИДВиИ, Екатеринбург

1 Контактная информация: galdm@mail.ru

DOI: 10.26295/OS.2020.63.83.005

Повышение результативности использования комплексных патоморфологических исследований для своевременной диагностики грибовидного микоза/ Н. В. Кунгуров, Г. Д. Сафонова, М. М. Кохан, О.Г. Римар, И. А. Куклин
Для цитирования: Лечащий врач № 5/2020; Номера страниц в выпуске: 27-32
Теги: кожа, лимфопролиферативные заболевания, биоптаты кожи, диагностика

Купить номер с этой статьей в pdf

Все новости и обзоры - в нашем канале на «Яндекс.Дзене». Подписывайтесь