Оценка антиокислительной активности различных соединений

Проблема свободнорадикального окисления в последнее время привлекает внимание ученых различных специальностей. Загрязнение окружающей среды, потребляемая пища и различные инфекционно-воспалительные заболевания являются причинами образования свободных радикалов в человеческом организме. Свободным радикалом считается химическое соединение, имеющее один или более неспаренных электронов и образованное путем потери или приобретения одного электрона. В человеческом организме постоянно образуются свободные радикалы [1]. Например, около 5% потребляемого тканями кислорода превращается в свободные радикалы, так называемые активные формы кислорода (АФК). В норме клетки инактивируют АФК при помощи анти­окислительной защитной системы, однако повышение уровня АФК сверх защитных возможностей клетки может вызвать серьезные клеточные нарушения. Значительное усиление процессов свободнорадикального окисления, связанное с увеличением содержания АФК, называется оксидативным стрессом [2]. При оксидативном стрессе свободные радикалы окисляют биологические макромолекулы, такие как ДНК, протеины, липиды, ингибируя их функциональную активность и инициируя мутации [3]. Доказано, что оксидативный стресс является причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе атеросклероза [4], гипертонии [5], диабета [6] и ряда других, а также является одной из причин старения.

Вещества, способные инактивировать свободные радикалы с образованием неактивных или менее активных форм, называют антиоксидантами. Антиоксиданты играют важную роль в регуляции протекания свободнорадикальных реакций в организме и существенно влияют на его состояние. В исследованиях, проведенных как in vitro, так и in vivo, было показано положительное влияние антиоксидантов на течение различных инфекционно-воспалительных заболеваний, доказано, что различные вещества имеют разную эффективность [7, 8]. Оценка антиокислительных свойств различных соединений является крайне актуальной задачей, однако стандартизованного метода оценки антиокислительной активности не существует [9]. Целью настоящей работы явилось выявление наиболее активных антиоксидантов, позволяющих ингибировать активные формы кислорода как в водной, так и в водно-органической средах, на модельных реакциях фотокаталитического окисления.

Материалы и методы исследования

Препараты: dl-альфа-токоферола ацетат (DSM nutritional products, Швейцария), аскорбиновая кислота (DSM nutritional products, Швейцария), дигидрокверцетин (Taxifolin hydrate, Sigma-Aldrich, США), метионин (ООО «Полисинтез», Россия), таурин (ООО «Полисинтез», Россия). Структурные формулы исследуемых препаратов представлены на рис. 1.

Оценку антиокислительной активности соединений проводили методом, описанным ранее [10]. В качестве фотосенсибилизатора использовали димегин (ДМГ) — динатриевую соль 2,7,12,18-тетраметил-3,8-ди (1-метоксиэтил)-13,17-ди (2-оксикарбонилэтил) порфирина, синтезированную в ИМБХ РАМН Г. В. Пономаревым. В качестве субстрата использовали водный или водно-спиртовой раствор антрацена (Sigma-Aldrich, США) или триптофана (Sigma-Aldrich, США) в отсутствие и в присутствии плюроника в концентрации 1 × 10^-5 М. Концентрация субстратов составляла 0,8–1,5 × 10^-4 М, концентрация фотосенсибилизатора составила 5 × 10^-6 М, исследуемые препараты вносили в концентрации от 1 × 10^-5 М до 1 × 10^-3 М. Реакционную смесь обрабатывали при помощи фототерапевтического светодиодного аппарата с длиной волны 400 нм, мощностью 210 мВт.

Результаты и обсуждение

При изучении антиокислительной активности соединений на модели фотоокисления антрацена в этиловом спирте в присутствии плюроника были получены данные, показывающие высокую антиокислительную активность dl-альфа-токоферола ацетата, аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина. Определенные в ходе работы эффективные константы окисления антрацена в отсутствие и в присутствии веществ показывают снижение до двух раз константы скорости реакции окисления. Установлено, что добавление плюроника в реакционную смесь не влияет на скорость протекания реакции фотоокисления. Ранее было показано, что плюроник влияет на скорость процессов фотосенсибилизированного окисления в водных растворах вследствие встраивания ДМГ в мицеллы полимера. Можно полагать, что причина отсутствия влияния полимера в данном случае заключается в том, что в спиртовых растворах плюроник находится в виде юнимеров [11]. На рис. 2 приведены зависимости констант скорости окисления антрацена в присутствии различных веществ в различных концентрациях. Видно, что при концентрациях веществ выше 5 × 10

^-5 М наблюдается падение констант скорости окисления. При этом наибольшее падение фиксируется при введении в реакционную среду аскорбиновой кислоты (рис. 2, кривая 2) или ее смеси с dl-альфа-токоферола ацетатом и персиковым маслом (рис. 2, кривая 3). Сравнение полученных констант скорости фотосенсибилизированного окисления антрацена в спирте в присутствии ДМГ (5 × 10^-6 М) дает основание считать наиболее активным антиоксидантом аскорбиновую кислоту. При этом в случае использования смеси dl-альфа-токоферола ацетата, аскорбиновой кислоты и персикового масла первоначально антиокислительная активность проявляется за счет аскорбиновой кислоты, затем ингибирующее действие оказывает смесь, содержащая dl-альфа-токоферола ацетат (витамин Е).

При изучении антиокислительной активности соединений на модели фотоокисления триптофана в водно-спиртовом растворе в присутствии плюроника (соотношение спирт/вода 1:1) были получены данные, показывающие высокую антиокислительную активность метионина. На рис. 3 представлена зависимость констант скорости окисления триптофана в присутствии метионина или таурина в различных концентрациях. При сравнении полученных данных видно, что в присутствии метионина наблюдается снижение константы скорости фотоокисления триптофана. В то же время таурин фактически не оказывает влияния на константу скорости процесса фотоокисления. Выявляемую разницу в антиоксидантных свойствах метионина и таурина можно связать с наличием в молекуле метионина реакционноспособной тиольной группы, тогда как в состав молекулы таурина входит устойчивая к окислению сульфогруппа. Следует отметить, что в присутствии таурина не наблюдалось изменений ни в значениях константы k_эфф^трп (рис. 3), ни в характере кинетических зависимостей. При этом наличие плюроника также не влияло на скорость фотоокисления субстрата и вид кинетических зависимостей для процесса фотоокисления триптофана.

Таким образом, по полученным данным можно сделать вывод о том, что dl-альфа-токоферола ацетат (витамин Е), аскорбиновая кислота (витамин С), дигидрокверцетин и метионин обладают антиокислительной активностью. Наиболее выраженная анти­окислительная активность обнаружена у аскорбиновой кислоты. При анализе смеси dl-альфа-токоферола ацетата, аскорбиновой кислоты и персикового масла первоначально антиокислительная активность проявляется за счет аскорбиновой кислоты, затем ингибирующее действие оказывает смесь, содержащая dl-альфа-токоферола ацетат (витамин Е) с персиковым маслом. Показано, что таурин не обладает антиокислительной активностью на модели фотосенсибилизированного окисления и не способен реагировать с активными формами кислорода.

Литература

1. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. 1998. № 7. С. 43–51.
2. Мартинович Г. Г., Черенкевич С. Н. Окислительно-восстановительные процессы в клетках. Минск: БГУ, 2006. 159 с.
3. Aitken R. John, Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and the Y chromosome // Reproduction. 2001. Vol. 122. Р. 497–506.
4. Morrow J. D. Quantification of isoprostanes as indices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2005. Vol. 25 (2). P. 279–286.
5. Wu L. et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. Vol. 101 (18). P. 7094–7099.
6. Giugliano D., Ceriello A., Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complications // Diabetes care. 1996. Vol. 19 (3). P. 257–267.
7. Васильев А. Н. Оценка влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона алфьа-2 b человеческого рекомбинантного в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток // Антибиотики и химиотерапия. 2010. № 7. C. 20–25.
8. Васильев А. Н., Дерябин П. Г., Галегов Г. А. Противовирусная активность антиоксидантов и их комбинаций с интерфероном альфа-2b человеческим рекомбинантным в отношении вируса гриппа птиц А/H5N1 // Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 2. C. 32–36.
9. Хасанов В. В., Рыжова Г. Л., Мальцева Е. В. Методы исследования антиоксидантов // Химия растительного сырья. 2004. № 3. C. 63–75.
10. Аксенова Н. А. и др. Особенности ингибирования реакции фотосенсибилизированного окисления антрацена и триптофана природными антиоксидантами // Журнал физической химии. 2013. Т. 87. № 8. С. 51.
11. Кудряшова Ю. Р. Самоорганизация неионных амфифильных соединений и их каталитический эффект в реакциях расщепления сложных эфиров и реакции кросс-сочетания. Дисс. канд. хим. наук: 02.00.04. М-2011. 179 с.

---

Н. А. Аксенова*^{, 1}, кандидат химических наук
А. А. Акованцева**
А. Б. Соловьева*, доктор химических наук, профессор
П. С. Тимашев**, кандидат химических наук

* ФГБУН ИХФ им. Н. Н. Семенова РАН, Москва
** ФГБУН ИПЛИТ РАН, Москва

¹ Контактная информация: naksenova@mail.ru