Исследование стероидного профиля мочи методом газовой хромато-масс-спектрометрии у больных с гиперандрогенией

Среди гормональных расстройств, приводящих к нарушению репродуктивной функции женщин, большое место занимает гиперандрогения [1, 2]. Избыточное количество андрогенов в организме женщины является результатом нарушений в системе гипоталамус–гипофиз–яичники–надпочечники и проявляется в нарушении менструального цикла (МЦ) и репродуктивной функции [3]. Определение источника гиперпродукции гормонов представляется сложной задачей лабораторной диагностики [4, 5]. Авторы отмечают многообразие форм гиперандрогении (ГА) [6]. Это относится, главным образом, к надпочечниковой гиперандрогении (НГА), одной из частых причин которой является стертая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН). У значительной части больных НГА может быть не связана с ферментными нарушениями биосинтеза стероидов [7]. В некоторых случаях ВГКН может протекать как синдром поликистозных яичников (СПКЯ). Следует отметить, что ожирение рассматривается как один из клинических признаков СПКЯ, поскольку встречается у 30–50% больных. Исследование роли ожирения в патогенезе заболевания выявило, что оно изменяет чувствительность тканей к инсулину, стероидогенез и продукцию гонадотропинов [8, 9]. Несмотря на многочисленные исследования, остаются спорными и недостаточно изученными биохимические критерии стертых форм ВГКН [10, 11]. Отсутствие клинических маркеров стертых форм ВГКН, возможность развития вторичных форм ферментных нарушений биосинтеза стероидов, сочетание НГА с СПКЯ осложняют поиск источника гиперпродукции андрогенов. Нет единой точки зрения в отношении критериев диагностики дефекта 21-гидроксилазы [12]. Определение 17-гидроксипрогестерона характеризуется высокой чувствительностью, но плохой специфичностью и в 85% случаев не позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [10]. Таким образом, представляется актуальным поиск дополнительных биохимических маркеров стертых форм ВГКН. С помощью методов иммуноанализа не всегда можно решить эти трудные диагностические задачи. Функциональные тесты могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Особое значение приобретают хроматографические методы анализа. Методом высокоэффективной жидкостной хромотографии (ВЭЖХ) были разработаны критерии диагностики 11β-гидроксилазы и дополнительные критерии диагностики недостаточности 21-гидроксилазы [13–15]. Ряд исследователей придают большое значение диагностике ферментативных нарушений адреналового стероидогенеза и изучению стероидных профилей мочи (СПМ) методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) [16]. Для оценки нарушений надпочечникового стероидогенеза отсутствуют четкие критерии выбора лабораторных методик, сведения о диагностической значимости исследуемых параметров, референтные значения для них. Решение данных вопросов необходимо для усовершенствования диагностики и выработки адекватной терапии пациентов с ГА.

Материалы и методы исследования

Обследовано 28 женщин репродуктивного возраста с ГА в возрасте от 18 до 40 лет (средний возраст 25,9 ± 1,1). Пациенты с ГА были разделены на 2 группы: 11 человек с нормальным весом (индекс массы тела (ИМТ) = 22,8 ± 1,5 кг/м²) — 1-я группа и 17 человек с ожирением (ИМТ = 36,1 ± 1,3 кг/м²) — 2-я группа. У пациентов 1-й группы признаком ГА был только гирсутизм, у пациентов 2-й группы, кроме гирсутизма, отмечены нарушения репродуктивной функции (бесплодие, нарушение менструального цикла, ановуляция по данным УЗИ). Контрольную группу составили 15 здоровых женщин в возрасте от 22 до 40 лет (средний возраст 28,5 ± 2,3). Определяли в крови уровни адренокортикотропного гормона (АКТГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), пролактина, кортизола (К), тестостерона (Т), дегидроэпиандростерона-сульфата (ДЭА-С) и глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), иммун��хемилюминесцентным методом, свободный тестостерон (СT), 5a-дигидротестостерон (ДГТ), Δ4-андростендион (Δ4-А), 17-гидроксипрогестерон (17-ОНП) определяли в крови иммуноферментным методом наборами фирмы DRG International. Проводили пробы с 2 мг дексаметазона и с кортикотропином пролонгированного действия (препарат Синактен депо). Методом ГХ/МС определяли экскрецию стероидов с мочой [15, 16]. СПМ были получены на газовом хромато-масс-спектрометре SHIMADZU GCMS-QP2010 ULTRA в ресурсном центре «Методы анализа состава веществ» Санкт-Петербургского государственного университета. С помощью этой методики идентифицировано 65 стероидов у больных с различными заболеваниями коры надпочечников. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программной системы Statistica for Windows (версия 7.0). Количественные показатели представлены в виде M ± m, где М — среднее арифметическое значение, m — стандартное отклонение от среднего. Статистически значимым считался критерий достоверности р < 0,05.

Результаты и обсуждение

У больных с ГА установлено повышение уровней в крови Т, СТ, ДГТ, Δ4-А и ДЭА-С (табл. 1). У пациентов 1-й группы отмечено увеличение ДГТ в крови в сравнении с группой здоровых. Уровень 17-НП в крови не отличался от соответствующего уровня у здоровых (1,4 ± 0,13 нг/мл, р = 0,5). Однако уровень 17-НП в крови был выше верхнего референсного значения у 4 больных 1-й группы (2,1 ± 0,4 нг/мл). По данным классических тестов недостаточность ферментов адреналового стероидогенеза не была установлена. При проведении пробы с дексаметазоном у больных с ГА установлено снижение уровней Т, ДЭА-С, СТ и Δ4-А более чем на 70%, уровень 17-НП при проведении пробы с Синактен депо составил 7,8 ± 0,9 нг/мл. Полученные на основании классических тестов результаты позволили отнести данных пациентов в группу с идиопатическим гирсутизмом. У пациентов 2-й группы были повышены уровни СТ, ДГТ и снижен уровень ГСПГ в сравнении с группой здоровых и пациентами 1-й группы, уровни в крови ДЭА-С и Т были повышены только в сравнении с группой здоровых лиц (табл. 1). Многие исследователи отмечают в своих работах увеличение СТ и снижение ГСПГ у больных СПКЯ [8, 9]. У пациентов 1-й и 2-й групп уровни в крови АКТГ, К в 9 ч и 21 ч не отличались от соответствующих показателей у здоровых (табл. 2).

Реклама

Методом ГХ/МС у пациентов 1-й группы установлено увеличение экскреции с мочой ДЭА и его метаболитов: 17β-андростендиола (17β-dA2), 16-ОН-ДЭА, андростентриола (dA3) и андростантриола (А3). Также отмечено повышение экскреции с мочой 17-ОН-прегнанолона (17Р), прегнандиола, прегнантриола (Р3), прегненолона (Р-on), уменьшение соотношений (ТНF + аllo-THF + ТНЕ)/Р3 (меньше 3,0) и (ТНF + аllo-THF + ТНЕ)/P-оn (меньше 60), что свидетельствует о недостаточности 21-гидроксилазы (табл. 3). Кроме того, у двух пациентов 1-й группы определен 21-дезокси-тетрагидрокортизол, который детектируется при недостаточности 21-гидроксилазы. У пациентов 1-й группы установлено также увеличение экскреции с мочой тетрагидрокортикостерона (ТНВ) и allo-ТНВ и снижение соотношения allo-THB/THB, что является одним из критериев увеличения активности 5α-редуктазы. У больных с ожирением установлены три критерия повышения активности 5α-редуктазы: увеличение соотношений андростерон/этиохоланолон (Аn/Et), 11-ОН-Аn/11-ОН-Еt и allo-тетрагидрокортизол/тетрагидрокортизол (табл. 3). Повышение экскреции с мочой тетрагидро-11-дезоксикортизола (ТНS) и снижение соотношения (ТНF + аllo-THF + ТНЕ)/ТНS (меньше 50) указывает на недостаточность 11β-гидроксилазы у пациентов 2-й группы. Признаком недостаточности 11β-гидроксилазы является определение экскреции с мочой гексагидро-11-дезоксикортизола, который был детектирован у трех больных с ожирением (584 ± 125 мкг/24 ч). Кроме того, у двух пациентов определена экскреция с мочой 16-оксо-андростендиона (50 ± 11 мкг/24 ч), который не был обнаружен у здоровых и у пациентов 1-й группы.

Выводы

1. Сочетание классических тестов с определением экскреции с мочой метаболитов андрогенов, прогестинов и глюкокортикоидов методом газовой хромато-масс-спектрометрии повышает точность диагностики дефектов адреналового стероидогенеза у больных с гиперандрогенией.
2. У больных с гиперандрогенией и нормальным индексом массы тела установлено повышение экскреции с мочой дегидро­эпиандростерона, 16-гидрокси-дегидроэпиандростерона, 17β-андростендиола, андростентриола, прегнантриола, прегнантриолона, уменьшение соотношений (ТНF + аllo-THF + ТНЕ)/прегнантриол (меньше 3,0) и (ТНF + аllo-THF + ТНЕ)/прегнантриолон (меньше 60), что свидетельствует о недостаточности 21-гидроксилазы.
3. У больных с гиперандрогенией и ожирением установлено снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны, увеличение свободного тестостерона и дигидротестостерона в крови в сравнении с пациентами с гиперандрогенией и нормальным индексом массы тела и с группой здоровых.
4. Увеличение активности 5α-редуктазы в большей степени установлено у больных с ожирением и гиперандрогенией и характеризуется повышением экскреции с мочой андростерона, аllo-тетрагидрокортикостерона, соотношений андростерон/этио­холанолон, 11-гидроксиандро­стерон/11-гидроксиэтиохоланолон, allo-тетрагидрокортикостерон/тетрагидрокортикостерон и allo-тетрагидрокортизол/тетрагидро­кортизол в сочетании с увеличением уровня дигидротестостерона в крови.
5. Недостаточность 11β-гидроксилазы, установленная у больных с гиперандрогенией и ожирением, характеризуется увеличением экскреции с мочой тетрагидро-11-дезоксикортизола, гексагидро-11-дезоксикортизола и соотношением (ТНF + аllo-THF+ТНЕ)/ТНS меньше 50.

1. Доброхотова Ю. Э., Рагимова З. Э., Ильина И. Ю., Ибрагимова Д. М. Гиперандрогения и репродуктивное здоровье женщины. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. 144 с.
2. Azziz R., Sanchez L. A., Knochenhauer E. S. et al. Androgen excess in women: experience with over 1000 consecutive patients // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004. Vol. 89, № 2. P. 453–462.
3. Чагай Н. Б., Фадеев В. В. Сложности дифференциальной диагностики и терапии неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников у пациенток репродуктивного возраста // Проблемы репродукции. 2009. № 3. С. 93–96.
4. White P. C, Speiser P. W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Endocr. Rev. 2000. Vol. 21. № 3. P. 245–291.
5. White P. S., Curnow K. M., Parcoe L. Disorders of steroid 11 β-hydroxylase isozymes // Endocr. Rev. 1994. Vol. 15. P. 421–438.
6. Azziz R., Carmina E., Sawata M. E. Idiopathic hirsutism // Endocr. Rev. 2000. Vol. 21. P. 347–362.
7. Великанова Л. И. Лабораторная диагностика идиопатического гирсутизма // Российский семейный врач. 2004. Т. 8, № 2. С. 76–79.
8. Беляков Н. А., Чубриева С. Ю., Глухов Н. В., Великанова Л. И., Чубкин И. В. Метаболические и гормональные нарушения при синдроме поликистозных яичников у женщин репродуктивного возраста. // Российский семейный врач. 2005. Т. 9, № 1. С. 27–33.
9. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS)/The Rotterdam ESHRE/ASRM-sponsored PCOS consensus workshop group // Hum. Reprod..2004. Vol. 19. P. 41–47.
10. Bachega T. A. S. S., Billerbeck A. E. C., Marcondes J. A. M. et al. Influence of different genotypes on 17-hydroxyprogesterone levels in patients with nonclassical congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Clin. Endocrinol. 2000. Vol. 52. P. 601–607.
11. Consensus statement on 21-hydroxylase deficiency from The European Society for paediatric endocrinology and The Lawson Wilkins Paediatric endocrine society. Joint ESPE/LWPES CAH working group // Horm. Res. 2002. Vol. 58. P. 188–195.
12. Özer G., Mungan N. Ö., Yüksel B. et al. Evaluation of patients with congenital adrenal hyperplasia // Ann. Med. Sci. 2000. Vol. 9. P. 108–112.
13. Карцова Л. А., Великанова Л. И., Павлова Е. Г., Бессонова Е. А. Изучение особенностей стероидогенеза больных с различными заболеваниями коры надпочечников методами обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. С. 1081–1087.
14. Великанова Л. И., Шафигуллина З. Р., Ворохобина Н. В., Бессонова Е. А, Сильницкий П. А. Диагностическое значение высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов при заболеваниях гипофизарно-надпочечниковой системы // Проблемы эндокринолоии. 2005. Т. 51. № 6. С. 9–12.
15. Серебрякова И. П., Ворохобина Н. В., Великанова Л. И., Сильницкий П. А., Стрельникова Е. Г. Особенности адреналового стероидогенеза у больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы // Проблемы эндокринологии. 2005. № 4. С. 22–27.
16. McDonald J. G., Matthew S., Auchus R. J. Steroid profiling by gas chromatography-mass spectrometry and high performance liquid chromatography-mass spectrometry for adrenal diseases // Hormones and Cancer. 2011. V. 2. C. 324–332.

Л. И. Великанова¹, доктор биологических наук, профессор
Н. В. Ворохобина, доктор медицинских наук, профессор
М. В. Татаринова

ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова МЗ РФ, Москва

¹ Контнактная информация: velikanovali@hotbox.ru