Фенотипы ювенильного идиопатического артрита

Термин «фенотип» происходит от греческого слова «phaino» — «являю» и обозначает совокупность множества признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития. В медицине фенотип традиционно рассматривался как результат взаимодействия генотипа (наследственных признаков организма) с условиями внешней среды [1, 2]. Разные авторы при выделении отдельных фенотипов описывают клинические и морфологические характеристики заболевания, наиболее значимые триггеры, наличие ведущего звена патогенеза заболевания, а также уникальные ответы на лечение [3].

Следующим этапом можно считать выделение эндотипов. В то время как фенотипы аутоиммунных заболеваний опираются на объективные характеристики, в основе эндотипов, по данным профессора Ян Лотвел (Швеция, 2012) лежат различные иммунные процессы, протекающие у конкретного больного при данном заболевании [4–7].

Идентификация отличных патофизиологических механизмов для разных фенотипов объясняет наличие эндотипов, выделение которых может привести к более эффективному лечению и контролю заболевания.

Современная классификация ювенильного идиопатического артрита (ЮИА) предусматривает выделение основных вариантов артритов. ЮИА — многофакторное заболевание с различными вариантами дебюта, разнообразным течением и часто с разным исходом заболевания.

Больные с хроническим артритом представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые объединяет тенденция к хроническому прогрессирующему течению, оказывающему значительное влияние на качество жизни больного ребенка и имеющему высокую вероятность его стойкой инвалидизации [8]. Именно поэтому большое значение отведено подбору оптимальной терапии и изучению факторов, влияющих на эффективность терапии ЮИА. «Золотым» стандартом в терапии ЮИА можно считать метотрексат (МТХ) — цитостатический препарат из группы антиметаболитов — антагонистов фолиевой кислоты. МТХ, попадая в кровь, связывается с альбуминами и проникает в клетку путем вариабельного захвата. Внутриклеточная концентрация метотрексата зависит не только от внеклеточной концентрации цитостатического препарата, но и от транспортеров элиминации, активно участвующих в удалении его из клетки.

При использовании относительно низких доз МТХ оказывает выраженное иммуносупрессивное действие, но не обладает заметной гематологической активностью [9].

Пациенты с одним и тем же вариантом ЮИА могут по-разному реагировать на получаемую терапию. Одной из причин резистентности к терапии может быть недостижение терапевтической концентрации базисного цитостатического препарата, вызванное различными механизмами. Это может быть связано со снижением поступления препарата в клетку, уменьшением аффинности дигидрофолатредуктазы к метотрексату, повышением концентрации дигидрофолатредуктазы, а также снижением полиглутаминирования вследствие уменьшения уровня фолатполиглутамилсинтазы [10]. На уровень концентрации цитостатических препаратов в клетке в том числе влияет активность гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1).

Работы по изучению гена MDR1 начались в 1980-е гг., когда впервые исследовали экспрессию белка Р-гликопротеина (Р-gp) [11], являющегося продуктом гена множественной лекарственной устойчивости. Общепризнано, что мембранные транспортеры, такие как P-gp, играют существенную роль в развитии множественной лекарственной устойчивости (Gottesman M. M. и Ling V., 2006). P-gp — типичный белок транспортера AТФ-связывающей кассеты, составленный из двух половин, каждая из которых соде��жит трансмембранную область и нуклеотид-связывающую область, отделенные гибким пространством. Взаимодействие двух половин P-gp важно для функционирования молекулы, и гибкая область соединения необходима для надлежащего взаимодействия этих двух половин, для связи между двумя сайтами ATФ [12, 13]. Кроме P-gp-зависимых механизмов элиминации цитостатических препаратов существуют и другие механизмы, влияющие на внутриклеточную концентрацию цитостатических препаратов. К транспортерам элиминации относится ABCG2/белок, продукт гена устойчивости рака молочной железы (BCRP), отвечающий за внутриклеточную концентрацию цитостатического препарата [14].

Физиологическая роль Р-gp подтверждается фактом наличия его в наибольшей концентрации в тканях, участвующих в выведении токсических соединений: эпителий бронхов, печень, легкие, кишечник и почки [11].

Целью настоящего исследования было изучить структурные (полиморфизм C3435T) и функциональные (Р-гликопротеин) особенности MDR1-гена у детей с ЮИА.

Методы исследования

Относительное количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих на своей мембране MDR-рецептор (Р-гликопротеин), определяли методом проточной цитометрии. Для этого кровь забирали из локтевой вены в утренние часы натощак и помещали в вакуумные пробирки Vacuette, содержащие литий-гепарин. Время транспортировки крови не превышало часа. 1 мл цельной периферической крови инкубировали в условиях 37 °С в атмосфере 5% СО₂ в течение 3 часов в отсутствии и присутствии 5 мкл ИЛ-2 (Ронколейкин — интерлейкин-2 человека рекомбинантный, 1 000 000 МЕ). Время инкубации и дозу ИЛ-2 (Ронколейкин) предварительно подбирали. Был проведен эксперимент, в котором инкубацию 10 образцов цельной гепаринизированной крови проводили с 0, 5, 1, 3, 5 и 10 мкл IL2. Параллельно подбирали время инкубации — 2, 3 и 4 часа. Наиболее значимые отличия в показателях относительного количества MDR-позитивных лимфоцитов в образцах без и с добавлением ИЛ-2 наблюдались при дозе препарата 5 мкл/1 мл крови и при инкубации в течение 3 часов. Данные условия эксперимента выбрали как наиболее адекватные для проведения дальнейшей работы. Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин в образцах крови до и после стимуляции ИЛ-2, было исследовано методом проточной цитометрии (FC500, Beckman Coulter) с использованием моноклональных антител к CD243 (CD243-PE, Beckman Coulter) по безотмывочной технологии с применением для лизиса эритроцитов OptiLyse C (Beckman Coulter, США). Оценку относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, проводили с использованием программного обеспечения СХР (Cytomics FC500, Beckman-Coulter, США). В лимфоцитарном гейте, выделенном на основании параметров прямого и бокового светорассеяния, анализировали 5000 событий (рис. 1).

Определение полиморфизма С3435Т MDR1-гена. Амплификация проводилась на приборе ICycler по стандартной двухпраймерной схеме. В качестве реакционной смеси для амплификации использовался «Комплект реагентов для проведения полимеразной цепной реакция (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в присутствии красителя SYBR Green I» согласно рекомендациям производителя (рис. 2).

Определение содержания цитокинов (интерлейкинов ИЛ-1β, ИЛ-6, фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α)) в сыворотке крови больных ЮИА проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем для определения ФНО-α человека, ИЛ-1β человека, ИЛ-6 человека, в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А. М. Никифорова МЧС России.

Определение концентрации метотрексата в сыворотке крови проводилось на анализаторе TDxFLx методом флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа.

Оценка активности заболевания проводилась на основании разработанных Carol A. Wallace с соавторами критериев «активной» и «неактивной» болезни. «Неактивная» болезнь — это отсутствие суставов с активным артритом, отсутствие лихорадки, сыпи, серозита, спленомегалии или генерализованной лимфоаденопатии, связанной с ЮИА, отсутствие обострения увеита, нормальные скорость оседания эритроцитов и С-реактивный белок [15].

Статистическая обработка результатов исследования проводилась при помощи пакета программ для персонального компьютера Microsoft Excel и пакета программ Statistica 6.0. Методы описательной статистики включали оценку среднего арифметического (М), ошибки среднего значения (m) и среднеквадратичного отклонения (σ) для признаков, имеющих нормальное распределение. Кроме того, нами были использованы элементы кластерного анализа. Кластерный анализ — это многомерная статистическая процедура, выполняющая сбор данных, содержащих информацию о выборке объектов, и затем упорядочивающая объекты в сравнительно однородные группы.

Результаты исследования

Нами обследованы пациенты с ювенильным идиопатическим артритом в возрасте от 2 до 17 лет. В исследование включено 103 пациента, по клинико-лабораторной картине отвечающие критериям ЮИА Международного конгресса ассоциации ревматологов (ILAR, Durban, 1997). По числу пораженных суставов и характеру течения заболевания все дети были разделены на 4 основные группы: «полиартрит», «олигоартрит», «системный артрит», «энтезитассоциированный артрит» (табл. 1). В качестве группы сравнения были обследованы 26 условно-здоровых детей без признаков аутоиммунных заболеваний.

Всем пациентам был определен полиморфизм С3435Т гена MDR1, в том числе детям из группы сравнения. Более половины пациентов в обеих группах имеют генотип СТ (58,25% среди больных с ЮИА и 57,69% в группе сравнения). Наиболее редким в обеих группах является генотип СС.

У больных ЮИА с генотипом ТТ прирост лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране P-гликопротеин (Lym P-gp), после стимуляции ИЛ-2 статистически значимо ниже, чем в группах пациентов с генотипами СТ и СС + СТ (табл. 2).

Хотелось бы отметить, что относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин до стимуляции ИЛ-2, в группе пациентов с ЮИА и в группе сравнения не отличалось, а относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин у детей с ЮИА, после стимуляции ИЛ-2 было статистически значимо выше, чем в группе условно-здоровых детей (табл. 3).

Группа детей, имеющих прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин после стимуляции ИЛ-2, состоит из 32 пациентов, среди которых больных олигоартритической формой ЮИА — 25%, детей с полиартритом — 43,75%, пациентов с системной формой ЮИА — 21,88%, а пациентов, страдающих энтезитассоциированным артритом, — 9,38%. Среди детей, у которых прирост относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, после стимуляции ИЛ-2 не определялся, пациентов с олигоартритом — 23,94%, с полиартритической формой ЮИА — 45,07%, детей с системной формой артрита — 9,86% и с энтезитассоциированным ЮИА — 21,13% (рис. 3).

Нами установлено, что у детей с «активной» болезнью относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин (как до, так и после стимуляции ИЛ-2), статистически значимо (p = 0,002) выше, чем у детей с «неактивной болезнью». Данная динамика относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин, позволяет предположить, что дети в стадии «активной» болезни имеют высокую «активность» MDR1-гена (рис. 4), который влияет на концентрацию цитостатического препарата в клетке, и при этом желаемый терапевтический эффект по подавлению иммунного воспаления получить не удается.

Проведенный анализ уровней ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α в сыворотке крови в зависимости от активности заболевания выявил разнонаправленные изменения цитокинов как в «активной», так и в «неактивной» болезни (табл. 4). Не отмечалось в группе «неактивной» болезни ожидаемого более низкого уровня ИЛ-1β и ИЛ-6.

Всем больным была определена концентрация МТХ в сыворотке крови, статистически значимых различий получено не было. В группе «неактивной» болезни средний уровень концентрации был 1,86 ± 0,13 мкмоль/л, а в группе «активной» болезни — 1,82 ± 0,13 мкмоль/л (рис. 5).

Используя методы статистического анализа, были определены 6 факторов, имеющих наибольшую связь с активностью заболевания: уровень лейкоцитов в крови, уровень альбуминов, бета- и гамма-глобулинов в сыворотке крови, относительное количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих на своей мембране P-гликопротеин как до, так и после стимуляции ИЛ-2. Для этих показателей с помощью метода классификационных деревьев были выявлены пороговые значения, определяющие увеличение вероятности перехода пациентов из «активной» болезни в «неактивную» (табл. 5).

Для определения вероятности перехода из «активной» болезни в «неактивную» следует суммировать полученные баллы по выделенным пороговым значениям.

Средние значения суммарного балла при «активной» болезни — 1,8 ± 0,2, а для «неактивной» болезни: 3,8 ± 0,3 (р < 0,001) (рис. 6).

Для удобства практического применения мы перешли к интервальной оценке суммарного балла. Шанс перехода из «активной» болезни в «неактивную» у больных с ЮИА повышается почти в 3 раза (OR = 2,66) при сумме от 1 до 2 баллов, при сумме 3 балла шансы повышаются в 8 раз (OR = 8,01), а при сумме 4 и более баллов вероятность увеличивается в 13 раз (OR = 12,61).

Обсуждение

Формирование хронического воспаления при ЮИА характеризуется как нарушениями во врожденном и приобретенном иммунитете, так и в апоптозе эффекторных клеток, синовиоцитов и фибробластов [16, 17].

У разных больных с одним и тем же фенотипом заболевания возможно преобладание одного из перечисленных выше механизмов реализации ауто­агрессии: активации Т-лимфоцитарного звена и/или В-лимфоцитарного звена, нарушения параметров врожденного иммунитета, апоптоза.

Существуют различные подходы для выделения фенотипов заболевания: на основании ведущего триггера, морфологических признаков, иммунологических показателей [16, 18, 19], а также используя методы многомерной статистики [20].

Хорошо известен факт, что у больных с системным вариантом артрита ведущим цитокином, приводящим к основным клиническим проявлениям заболевания, является ИЛ-6, в то время как при артикулярных формах преобладает нарушение выработки ФНО-α. В связи с этим наиболее эффективным генно-инженерным препаратом у больных с системным вариантом является тоцилизумаб (ингибитор ИЛ-6), в то время как при артикулярных вариантах препаратами выбора являются ингибиторы ФНО-α [21].

В понятие фенотипа ЮИА наиболее целесообразно включать набор признаков, формирующихся на основе генотипа пациента, клинических вариантов течения ЮИА, особенностей иммунологических механизмов формирования заболевания (рис. 7). Группирование хронических артритов по фенотипам позволило бы разработать более эффективные методы контроля течения заболевания.

С целью стимуляции в лимфоцитарную суспензию больным ЮИА

in vitro был добавлен ИЛ-2 (Ронколейкин) с последующей оценкой продукта MDR1-гена (гена множественной лекарственной устойчивости-1) по относительному количеству лимфоцитов, экспрессирующих P-гликопротеин. MDR1-ген работает как насос, который выкачивает цитостатический препарат из клетки. Создание терапевтической концентрации метотрексата в клетке зависит как от функциональной активности MDR1-гена, так и от MDR1-независимых механизмов (активность дигидрофолатредуктазы, фолатполиглутамилсинтазы). По нашим данным у больных с ЮИА, отвечающих критериям «активной» болезни, было выявлено повышение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих P-gp (до и после стимуляции ИЛ-2), по сравнению с пациентами с «неактивной» болезнью. Несмотря на прирост P-gp на лимфоцитах после обработки ИЛ-2 in vitro, у части детей с ЮИА определялась более низкая концентрация МТХ в сыворотке крови, чем у остальных детей с ЮИА. Эти данные указывают на преобладание у данной категории больных с ЮИА MDR1-зависимых механизмов, контролирующих создание терапевтической концентрации цитостатических препаратов.

MDR1-ген не является уникальным механизмом реализации создания терапевтической концентрации у больных с ЮИА [22].

Используя клинические, иммунологические, биохимические и молекулярно-генетические показатели, нами были выделены, по крайней мере, 2 фенотипа ЮИА (рис. 8).

Для MDR1-зависимого фенотипа характерны более высокая активность заболевания, высокие уровни ФНО-α и ИЛ-6. Этот фенотип чаще встречается у пациентов с генотипом СТ и СС полиморфизма С3435Т гена MDR1, отмечается более высокое относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин как до стимуляции ИЛ-2, так и после; характерна низкая концентрация МТХ в сыворотке крови. MDR1-независимый фенотип характеризуется более низкой активностью заболевания, низким содержанием ФНО-α и ИЛ-6 в сыворотке крови, наиболее часто встречаемый генотип ТТ полиморфизма С3435Т MDR1-гена. Характерно более низкое относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих Р-гликопротеин как до стимуляции ИЛ-2, так и после, и более высокие значения концентрации МТХ в сыворотке крови.

После проведения анализа полученных результатов мы можем предположить, что изучение полиморфизма гена MDR1 необходимо для оценки влияния различных механизмов на концентрацию метотрексата у больных с ЮИА, предоставляет возможность моделировать дозу метотрексата в зависимости от ответа на терапию. Так, у пациентов с MDR-зависимым фенотипом можно рассматривать более раннее назначение генно-инженерных биологических препаратов.

Выделение фенотипов болезней может позволить индивидуализировать проводимую терапию для достижения лучшего контроля течения заболевания.

Литература

1. MeiLan K. Han, Alvar Agusti, Peter M. Calverley et al. Chronic Obstructive Pulmonary Disease Phenotypes // American journal of respiratory and critical care medicine. 2010, vol. 182, р. 598–604.
2. Королева А. А., Журавков Ю. Л. Фенотипы хронической обструктивной болезни легких // В помощь войсковому врачу. 2013, с. 51–53.
3. Курбачева О. М., Павлова К. С. Фенотипы и эндотипы бронхиальной астмы: от патогенеза и клинической картины к выбору терапии // Российский аллергологический журнал. 2013, № 1, с. 15–24.
4. Standl M., Sausenthaler S., Lattka E. et al. FADS gene cluster modulates the effect of breastfeeding on asthma. Results from the GINIplus and LISAplus studies // Allergy. 2012, 67, p. 83–90.
5. Hesselmar B., Enelund A.-C., Eriksson B. The Heterogeneity of Asthma Phenotypes in Children and Young Adults // Journal of Allergy Volume. 2012.
6. Wendy C. Moore, Deborah A. Meyers, Sally E. Wenzel. Identification of Asthma Phenotypes Using Cluster Analysis in the Severe Asthma Research Program // American journal of respiratory and critical care medicine. 2010, vol. 181, p. 315–323.
7. Jan Lotvall, Cezmi A. Akdis, Leonard B. Bacharier. Asthma endotypes: A new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome // J allergy clin immunol. 2011, p. 355–360.
8. Кузьмина Н. Н., Воронцов И. М., Никишина И. П., Салугина С. О. Эволюция взглядов на терминологию и классификацию ювенильных хронических артритов // Научно-практическая ревматология. 2001, № 1.
9. Khan Z. A., Tripathi R., Mishra B. // Methotrexate: a detailed review on drug delivery and clinical aspects // Expert Opin. Drug Deliv. 2012. Vol. 9 (2). P. 151–169.
10. Zulfequar Ahamad Khan, Rahul Tripathi & Brahmeshwar Mishra. Methotrexate: a detailed review on drug delivery and clinical aspects // Expert Opin. Drug Deliv. 2012, 9 (2), p. 151–169.
11. Миронова Ж. А., Трофимов В. И., Симакова М. А. и др. Ген множественной лекарственной устойчивости (MDR1) — маркер терапевтической резистентности и степени тяжести заболеваний // Российский аллергологический журнал. 2010, № 3. с. 9–13.
12. Luca Cantarini, Gabriele Simonini, Bruno Frediani et al. Treatment strategies for childhood noninfectious chronic uveitis: an update // Expert Opin. Investig. Drugs. 2012, 21 (1).
13. Zuben E. Sauna, In-Wha Kim, Suresh V. Ambudkar. Genomics and the mechanism of P-glycoprotein (ABCB1) // J Bioenerg Biomembr. 2007, 39: 481–487.
14. Noguchi K., Katayama K., Sugimoto Y. Human ABC transporter ABCG2/BCRP expression in chemoresistance: basic and clinical perspectives for molecular cancer therapeutics // Pharmacogenomics and Personalized Medicine. 2014, 7: 53–64.
15. Carol A. Wallace. Current management of juvenile idiopathic arthritis // Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 2006, p. 279–300.
16. Кожевников А. Н. Полиморфизма гена апоптоза р53 у больных ювенильным идиопатическим артритом. Автореферат дис. … к.м.н. СПб, 2013.
17. Кайлина А. Н. // Клинико-диагностическое значение матриксных металлопротеиназ при ювенильных артритах у детей. Автореферат дис. … к.м.н. Томск, 2013.
18. Nishimoto N., Kishimoto T. Humanized Antihuman IL-6 Receptor Antibody, Tocilizumab // Therapeutic Antibodies Handbook of experimental Pharmacology.
19. Турцевич И. З., Новик Г. А. Роль TH17 пути дифференцировки лимфоцитов а патогенезе ювенильного идиопатического артрита / Материалы III Российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века. Санкт-Петербург-2011» 1–2 декабря 2011 г. СПб, 2011. С. 123–128.
20. Quesniaux V., Ryffel B., Padova F. D. Th17 cells: Role in inflammation and autoimmune disease. 2009.
21. Ненашева Н. М. Современное представление о фенотипах бронхиальной астмы // Фарматека. 2013, № 14.
22. Рохлина Ф. В., Новик Г. А., Калинина Н. М., Бычкова Н. В., Филиппова Ю. Н., Зарайский М. И. // Влияние полиморфизма С3435Т гена MDR1 на эффективность терапии ювенильного идиопатического артрита // Педиатрическая фармакология. 2013; 10 (5): 46–51.

---

Ф. В. Рохлина*^{, 1}
Г. А. Новик*, доктор медицинских наук, профессор
Н. М. Калинина**, доктор медицинских наук, профессор
Н. В. Бычкова**, кандидат биологических наук

* ГБОУ ВПО СПбГПМУ МЗ РФ, Санкт-Петербург
** ФГБУ ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург

¹ Контактная информация: faina.rokhlina@gmail.com