Способ прогнозирования наступления беременности у пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения, в стандартном длинном протокол

В условиях демографического кризиса проблема бесплодия приобретает особое значение. Частота бесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), считается критическим уровнем. Наиболее частой причиной женского бесплодия является полная или частичная непроходимость маточных труб в результате перенесенных заболеваний органов малого таза [1]. Большое значение в положительном исходе программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) играет возраст пациенток. Пациенты позднего репродуктивного возраста составляют самый тяжелый контингент для клиник репродукции: на преодоление бесплодия им требуется намного больше попыток ЭКО и подсадки эмбриона (ПЭ), а следовательно, и экономических затрат. Естественная фертильность женщин с возрастом уменьшается, в 35–39 лет она падает на 26–46%, а в возрасте 40–45 лет — на 95% [2]. Одновременно возрастает количество самопроизвольных абортов, составляя 50–75% у женщин старше 40 лет. Аналогичная тенденция наблюдается и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) — на 1 перенос эмбриона шанс рождения ребенка у женщин младше 35 лет составляет около 41%, в возрасте 35–37 лет — 35%, для возрастной группы 38–40 лет — 25%, 41–42 лет — 15%, 43 лет — 6% и ниже 3% для женщин старше 43 лет [3]. Следовательно, повышение эффективности программ ЭКО и ПЭ особенно актуально у пациенток старшей возрастной группы.

Необходимым условием реализации всей программы ЭКО является успешная имплантация. По этой причине в качестве критерия оценки эффективности ВРТ часто используют этот параметр (по данным ультразвукового исследования (УЗИ)). В целом под понятием эффективности ЭКО подразумевают долю успешных исходов программы к общему числу попыток. В идеале это соотношение должно равняться 1. Каждая неудачная попытка пагубно отражается не только на психическом, но и соматическом здоровье будущей мамы, поэтому важно не допустить пациентку в протокол, если шансы на успех у нее невысоки. Именно по этой причине в нашей работе пристальное внимание уделено поиску имеющих прогностическую ценность клинико-лабораторных параметров пациенток, которые позволят предсказать исход ЭКО до начала стимуляции суперовуляции.

Прогноз успеха имплантации перед лечением необходим для отбора наиболее перспективных с физиологических позиций пациенток и включения их в программу ВРТ. Такой подход, с одной стороны, повысит эффективность программы ЭКО, а с другой — позволит отдельным пациенткам избежать чрезмерной гормональной нагрузки и получить направленное лечение.

В качестве кандидатов в критерии прогноза эффективности ЭКО могут выступать ключевые регуляторные молекулы имплантации, поддающиеся лабораторному анализу. Имплантация — сложный процесс, включающий взаимодействие эмбриона и тканей репродуктивного тракта, а также гормональных сигналов, модулирующих необходимые компоненты. Имплантация и пролонгация беременности во многом зависят от ответной иммунной реакции организма матери на отцовские антигены эмбриона. В частности, под влиянием прогестерона лимфоциты вырабатывают белок — прогестерон-индуцированный блокирующий фактор, который оказывает антиабортивное действие и способствует сохранению беременности [4]. Следовательно, активность прогестерона пациенток связана с успехом имплантации. При этом различия в уровне прогестерона в плазме крови у пациенток с разными исходами ЭКО не выявлены [5]. Отсутствие имплантации может быть связано с чувствительностью клеток-мишеней к стероиду. В нашем исследовании с помощью радио-лигандного анализа определялось специфическое связывание меченого гормона с иммунокомпетентными клетками, характеризующее общую рецепторную емкость объекта. Используя метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) мы показали, что связывание прогестерона мононуклеарной фракцией осуществляется рецепторами типа mPR. В настоящее время доказано существование 4 типов рецепторов прогестерона — два из них известны как ядерные рецепторы ПР-А и ПР-В, третий тип — 7 раз пронизывающий мембрану g-белок, связывающий рецептор, именуемый mPR, и четвертый тип — белок, один раз пронизывающий мембрану, под именем PGRMC1 [6]. Два последних варианта рецепторов опосредуют быстрые не геномные эффекты стероида. Рецепторный статус клеток в свою очередь находится под комплексным контролем, с одной стороны, количество стероидных рецепторов в лимфоцитах увеличивается при их аллогенной или митогенной стимуляции [7]. С другой стороны, существует ауто- и гетерорегуляция стероидных рецепторов половыми гормонами. Рабочая гипотеза нашего исследования основывалась на тезисе, что дисрегуляция стероидного рецепторного аппарата в иммунокомпетентных клетках может быть причиной нарушения имплантации [8]. Следовательно, параметры такой рецепции рационально использовать в качестве маркера прогноза успеха имплантации и, в конечном итоге, ЭКО. Таким образом, целью нашей работы явился анализ рецепции половых стероидов в мононуклеарной фракции крови (МНФК) у пациенток, участвующих в вспомогательной репродуктивной технологии, для выявления критерия прогноза успеха ЭКО.

Материалы и методы исследования

В исследование вошли 50 женщин 26–38 лет, включенных в программу ЭКО, которые наблюдались на базе отделения ЭКО за период осень 2007 — весна 2010 г. (зав. отделением ЭКО КДО — врач высшей категории Е. Г. Лебедева) Центра планирования семьи и репродукции (главный врач центра — главный акушер-гинеколог г. Москвы, чл.-корр. РАМН, профессор М. А. Курцер) и на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П. В. Сергеева медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова (зав. кафедрой — чл.-корр. РАМН, профессор Н. Л. Шимановский).

Условиями включения в исследование явилось отсутствие у пациенток тяжелой соматической патологии и выраженных метаболических нарушений, а также бесплодный брак.

Пациенток ретроспективно разделили на две группы в зависимости от результатов лечения: в I группу вошли 28 пациенток с наступившей беременностью, во II — 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ. Дальнейший анализ результатов проведенных исследований проводился по группам. Анализ анамнестических данных показал, что возраст пациенток составил в среднем 33,08 ± 3,40 года. Большее количество женщин, включенных в исследование, относится к позднему репродуктивному возрасту, тогда как к репродуктивному возрасту относятся 44% исследуемых.

Дальнейший анализ анамнестических данных показал, что пациентки также могут быть разделены на группы по фактору бесплодия, количеству попыток ЭКО, наличию или отсутствию синдрома гиперстимуляции яичников и длительности бесплодия. Пациенткам обеих групп был определен клеточный состав МНФК с помощью проточной цитофлуориметрии. Результаты проведенного анализа находились в пределах референсных значений для данной возрастной группы.

Средние данные по фракционному составу МНФК приведены в табл. 1.

Обе группы пациенток были обследованы по ряду основных анамнестических данных. Эти данные приведены в табл. 2.

Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum

Кровь с гепарином (10 мл) разводили таким же количеством прозрачного раствора Хэнкса, то есть в соотношении 1:1. Затем кровь с раствором Хэнкса в объеме 5 мл наслаивали на 3 мл теплого раствора фиколла-урографина, после чего центрифугировали 45 минут при 2000 об./мин. После центрифугирования стерильной пипеткой отбирали фракцию мононуклеаров. Полученную фракцию переносили в чистую пробирку и раствором Хэнкса доводили объем до 10 мл. Далее центрифугировали 15 минут при 1600 об./мин, после чего сливали надосадочную жидкость и раствором Хэнкса доводили объем до 10 мл, затем центрифугировали 15 минут при 1600 об./мин. Далее сливали надосадочную жидкость и получали суспензию МНФК. Все операции проводились в температурном режиме 0–4 °С. Выделенную фракцию МНФК периферической крови оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии. Полученные данные соответствовали нормативным значения для данных групп пациентов.

Для определения общего связывания пробы содержали 20 мкМ [9, 10, 12, 13] ³Н-Р₄ и 1 мМ гидрокортизона и 5 мкМ [10–13] ³Н-Е₂ в исследуемой фракции крови. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 3 мМ спиртовой раствор прогестерона и 1 мМ спиртовой раствор ди­этилстильбэстрола соответственно. Этанол, после раскапывания, испаряли в токе азота. Затем добавляли исследуемую фракцию крови и инкубировали 60 минут для определения связывания прогестерона и 30 минут — для определения связывания эстрадиола, после чего по 100 мкл суспензии из каждой лунки помещали на стеклянные фильтры и промывали 100-кратным избытком TED-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол; pH 7,4). Стеклянный фильтр из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Все исследования проводились в триплетах. Связывание стероидных гормонов в МНФК выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мкл фракции.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ GraphPad Prism 5, для каждой из непрерывных величин приведены среднее (М) и стандартное отклонение (CD) или медиана и верхняя и нижняя квартили в зависимости от типа распределения исследуемой величины. Гипотеза о нормальном распределении изучаемого показателя проверялись с использованием критерия Шапиро–Вилка. При сравнении групп пациентов по основным показателям, полученным при включении в исследование, в зависимости от характера распределений использовался U-критерий Манна–Уитни. Для статистического изучения связи между различными параметрами применялся непараметрический метод — коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты и их обсуждение

Результаты определения гормонального статуса пациенток показали, что уровень женских половых стероидов и их соотношение у женщин до лечения в обеих группах находились в пределах нормативных значений. Таким образом, уровень половых гормонов при первичном обследовании пациенток не может служить надежным критерием успеха ЭКО, что совпадает с литературными данными.

Среднее значение специфического связывания эстрадиола в МНФК у пациенток I группы в середине лютеиновой фазы (21–23 день) менструального цикла, предшествующего циклу ЭКО, составило 2,79 фемтомоль ³Н-Е₂/млн клеток. В случае нереализованной попытки ЭКО (II группа) данный параметр составил 2,59 фемтомоль ³Н-Е₂/млн клеток, что оказалось статистически не значимо.

Среднее значение специфического связывания прогестерона в МНФК у пациенток I группы в середине лютеиновой фазы (21–23 день) менструального цикла, предшествующего циклу ЭКО, составило 4,78 фемтомоль 3Н-Р4/млн клеток. У пациенток с отсутствием имплантации (II группа) данный параметр был в 1,5 раза ниже и составил 3,32 фемтомоль ³Н-Р₄/млн клеток (р = 0,043). Выявленное достоверное различие в рецепции прогестерона в сравниваемых группах послужило основанием для использования данного параметра в качестве критерия прогноза эффективности длинного протокола ЭКО (рис. 1). Для определения пограничных значений данного параметра нами проведен регрессионный анализ.

Дополнительным подтверждением информативности предложенного нами критерия явились отдаленные результаты у пациенток II группы, у которых не наступила беременность в нашем исследовании. В частности, у 10 женщин, имевших более высокие значения уровня рецепторов прогестерона в мононуклеарах, наступила беременность в последующие 2 года — у двоих самопроизвольно, у 8 — в результате повторных попыток ЭКО, в отличие от 12 пациенток с низким значением рецепции половых стероидов, у которых беременность так и не наступила.

С помощью дискриминантного анализа экспериментальных данных нами вычислено пороговое значение уровня рецепции прогестерона в МНФК, позволяющее с 95% уверенностью прогнозировать принадлежность конкретной пациентки к одной из групп. Это пороговое значение уровня рецепторов прогестерона (РП) в МНФК у пациенток на 21–23 день менструального цикла составило 1,3 фемтомоль/млн клеток, которое и было предложено нами в качестве критерия прогноза эффективности программы ЭКО. Предложенный критерий использован в разработке алгоритма введения пациенток в программу ЭКО с целью повышения эффективности вспомогательной репродуктивной технологии.

На основании полученных данных с целью повышения эффективности ЭКО нами разработан алгоритм введения пациенток в программу (рис. 2). При соблюдении всех требований к включению пациенток в цикл ЭКО первым этапом предлагается проведение анализа рецепции прогестерона в мононуклеарах в середине лютеиновой фазы менструального цикла. Уровень РП более 1,3 фемтомоль/млн клеток будет расцениваться как положительный прогностический признак успеха ЭКО, у пациенток с более низкими значениями предложенного критерия стимуляция суперовуляции будет отложена на время проведения предгравидарной подготовки. По материалам исследования получен патент № 2430379 от 27.09.11 [14].

Экзамен алгоритма на обучающей выборке показал, что чувствительность предложенного критерия составила 81%, а специфичность 53%, что удовлетворяет требованиям к показателю прогностических возможностей маркера (AUC). AUC — это вероятность отличить больного от здорового, ориентируясь на маркер. В нашем случае данная величина составляет 0,71 и является хорошим классификатором в прогностической ценности маркера.

Заключение

Специфическое связывание прогестерона в МНФК у пациенток с успешной имплантацией в среднем выше в 1,5 раза (р = 0,043) по сравнению со второй группой пациенток с отсутствием имплантации. Разработан алгоритм введения пациенток в программу ЭКО на основании значения специфического связывания прогестерона в МНФК, равного 1,3 фемтомоль/млн клеток.

Литература

1. Кулаков В. И. Репродуктивное здоровье населения Poccии // Consilium medicum. 2007. № 2. С. 26.
2. Maroulis G. B. Effect of aging on fertility and pregnancy // Seminars Reprod Endocrinol. 1991. С. 165.
3. Coulam C. B., Roussev R. G. Increasing circulating T-cell activation markers are linked to subsequent implantation failure after transfer of in vitro fertilized embryos // AJRI. 2003. № 50. С. 340–345.
4. Genazzani A. Solvey Farmaceutical Sympoz // Synergy Med. Education. 2002. С. 11–13.
5. Lessey B., Castlebaum A., Sawin S. et al. Aberrant integrin expression in the endometrium of women with endometriosis // Fertil Steril. 1994. С. 643–649.
6. Сергеев П. В., Шимановский Н. Л. Рецепторы. Учебник. В., 1999. С. 640.
7. Radhupathy R. et al. Functions of embryonic interferons and of the main serum proteins specific for pregnancy // Hum Reprod. 2000. С. 713–718.
8. Карева Е. Н., Гаспарян Н. Д., Маняхина А. Е., Горенкова О. С. Рецепторы прогестерона и эстрадиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста с миомой матки // Психофармакология и биологическая наркология. 2007. № 7. С. 1717–1718.
9. Алиева К. У. Оптимизация подготовки эндометрия в программе экстракорпорального оплодотворения у пациенток с нарушением маточной гемодинамики. Автореф. дис. канд. мед. наук. 2007. С. 23.
10. Аншина М. Б. ВРТ: прошлое, настоящее, будущее // Проблемы репродукции. 2002. № 3. С. 6–15.
11. Бассалык Л. С. Рецепторы стеродных гормонов в опухолях человека. М.: Медицина, 1987. С. 223.
12. Вихляева Е. М., Железнов Б. И., Запорожан В. Н. и др. Руководство по эндокринной гинекологии. Под ред. Е. М. Вихляевой. М.: Медицинское информационное агентство, 1997. С. 154.
13. Герштейн Е. С., Кушлинский Н. Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практическая онкология. 2002. Т. 3, № 1. С. 38–44.
14. Савельева Г. М., Шимановский Н. Л., Клименко П. А., Карева Е. Н. и др. Способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции супер­овуляции / Изобретения. Полезные модели. № 27 2011. С. 940.

Г. М. Савельева, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
П. А. Клименко, доктор медицинских наук, профессор
Е. Н. Карева, доктор медицинских наук, профессор
Л. М. Каппушева, доктор медицинских наук, профессор
М. П. Клименко, кандидат медицинских наук
М. В. Сукновалова
Л. Х. Бехбудова

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова МЗ РФ, Москва

Контактная информация об авторах для переписки: maniaj@mail.ru