Влияние противоаллергических лекарственных средств интраназального применения на частоту колебаний ресничек мерцательного эпителия носовой полости чел

Мукоцилиарный клиренс является важным защитным механизмом мерцательного эпителия носовой полости [1]. Было установлено, что это комплексная, точно уравновешенная система, состоящая из слоя слизи, которая перемещается метахронально колеблющимися ресничками клеток мерцательного эпителия, может подвергаться воздействию не только патологических процессов, таких как, например, острый или хронический ринит [2, 3] или аллергия [4], но и большого количества лекарственных веществ [5, 6].

На протяжении последних десятилетий для местного лечения (слизистая оболочка носовой полости) сезонного и хронического аллергического ринита успешно применяется несколько новых лекарственных веществ [7, 8]. Высокая эффективность современных назальных спреев в облегчении местных симптомов аллергии обусловлена содержанием в них динатрия кромогликата (стабилизатор мембран тучных клеток) или антагониста H1-рецепторов — азеластина [9–11]. Назальные противоаллергические спреи являются одними из наиболее широко используемых фармацевтических препаратов. В то же время об их влиянии на активность мерцательного эпителия полости носа известно очень мало.

В данном исследовании мы оценили влияние трех различных противоаллергических лекарственных средств для интраназального применения на частоту колебания ресничек (ЧКР) мерцательного эпителия полости носа in vitro. ЧКР является основной характеристикой мукоцилиарной активности мерцательного эпителия полости носа.

Материалы и методы

Исследование было проведено на клетках мерцательного эпителия носовой полости человека in vitro. Схема проведения экспериментальной части исследования представлена на рис. 1.

При помощи малой ушной кюретки у 16 здоровых добровольцев с задней части нижней носовой раковины брались клетки мерцательного эпителия носовой полости. Местное обезболивание не проводилось. Клеточную суспензию получали путем перемешивания кюреткой (на которой находились взятые у добровольцев клетки) 700 мкл стерильной среды для клеточных культур (среда «Игла модифицированная по способу Дульбекко» (СИМД), Sigma Chemicals Co., Сент-Луис, Миссури, США). Клеточная суспензия и добавляемые позднее препараты выдерживались при постоянной температуре, равной 37 °C, на протяжении всего периода оценки.

После микроскопического изучения на предмет клеточного содержимого и жизнеспособности клеток каждую клеточную суспензию делили на 6 порций (образцов) по 100 мкл каждый. При этом два образца использовались в качестве контроля и оценивались в начале (C-до) и в конце (C-после) оценочного периода. Остальные образцы последовательно инкубировались в течение 20 минут с 10 мкл раствора одного из исследуемых лекарственных веществ. В соответствии с планом эксперимента, четыре исследуемых раствора были помещены в прозрачные колбы и промаркированы от A до D. Порядок обработки исследуемых растворов был рандомизирован. Во время оценки результатов исследователь не знал точных условий эксперимента (слепая оценка). Соответственно, исследователь не был осведомлен о содержимом исследуемого образца.

Измерение ЧКР проводилось в конце каждого периода инкубации (t = 20 мин) при помощи фотоэлектрического метода, подробно описанного в других источниках [1, 12]. Для этого небольшое количество каждой клеточной суспензии помещалось в камеру Фукса–Розенталя и изучалось под микроскопом. При этом в каждой суспензии в течение 10 секунд оценивались 10 активных клеток.

Были исследованы следующие противоаллергические лекарственные средства: зарегистрированный 2-процентный раствор препарата динатрия кромогликата; новый препарат, содержащий 0,1-процентный раствор антагониста H1-рецепторов диметиндена малеата (который пока еще не назначается для местного интраназального лечения), а также зарегистрированный 0,1-процентный раствор препарата азелазина гидрохлорида. Для количественной оценки влияния бензалкония хлорида (консерванта, который входит в состав всех исследованных препаратов) в таком же порядке были оценены образцы с плацебо, содержащие 0,022-процентный раствор бензалкония хлорида. При помощи цифрового pH-метра 646 (Fa. Krick, Германия) были измерены значения pH исследованных лекарственных препаратов при температуре 37 °C как в чистом виде, так и в растворах, использовавшихся для исследования in vitro. Концентрации противоаллергических препаратов, концентрации бензалкония хлорида, а также значения pH чистых препаратов и их растворов представлены в табл.

На материале, полученном от нескольких здоровых добровольцев, согласно рандомизированному блочному дизайну исследования, было проверено действие четырех веществ. Для проверки постоянства свойств клеточной суспензии ЧКР контрольных образцов суспензии клеток в питательной среде измерялась до (C-до) и после (C-после) инкубации четырех тестовых растворов. Корреляция между C-до и C-после оценивалась при помощи определения корреляционного коэффициента и сравнения значений ЧКР по двустороннему t-критерию. Значения ЧКР в группах четырех указанных препаратов сравнивались между собой и с контрольным значением. Контрольное значение получали путем усреднения значений C-до и C-после. Применить параметрический метод для анализа результатов в указанных четырех группах не представилось возможным по причине наличия большого количества нулевых значений в одной из групп. Поэтому для анализа использовался непараметрический метод Фридмана. Уровни значимости представлялись с каждым результатом.

Результаты

В контрольных образцах значение ЧКР в C-до составило 11,2 ± 1,2 Гц (среднее значение ± δ, где δ — среднеквадратическое отклонение), а в C-после — 11,6 ± 1,5 Гц (P ≤ 0,05). Коэффициент корреляции между C-до и C-после составил r = 0,92. Таким образом, среднее значение контроля составило 11,4 ± 1,3 Гц.

Полученные средние значения ЧКР для четырех групп исследованных образцов представлены на рис. 2. Значение ЧКР в случае с плацебо оказалось сниженным до 9,7 ± 2,3 Гц (статистически незначимо относительно контроля). Воздействие средства, содержащего динатрия кромогликат, снижало ЧКР до 9,7 ± 2,0 Гц (статистически незначимо относительно контроля, статистически незначимо относительно плацебо). Воздействие средства, содержащего диметиндена малеат, снижало ЧКР до 7,2 ± 1,7 Гц (P ≤ 0,05 относительно контроля и плацебо, статистически незначимо относительно динатрия кромогликат). Воздействие средства, содержащего азеластина гидрохлорид, снижало ЧКР до 0,9 ± 1,8 Гц (P ≤ 0,001 относительно контроля, P ≤ 0,001 относительно плацебо, P ≤ 0,001 относительно динатрия кромогликат, статистически незначимо относительно диметиндена малеата; в 9 из 16 случаев было выявлено полное прекращение движений ресничек).

Обсуждение

Известно, что у пациентов, страдающих от аллергического ринита, ЧКР снижается и, соответственно, время назального мукоцилиарного клиренса (ВНМЦК) увеличивается, независимо от степени аллергенной нагрузки [4, 13]. Было установлено, что мерцательная активность ресничек снижается по мере увеличения срока течения заболевания [4]. После острой аллергенной нагрузки у пациентов, страдающих аллергическим ринитом, ВНМЦК увеличивается (у разных пациентов в разной степени), в основном вследствие значительного усиления носовой секреции [13]. Индивидуальные особенности мукоцилиарного клиренса пациентов, страдающих аллергическим ринитом, делают маловероятным получение статистически достоверных результатов в клиническом исследовании по сравнительному изучению влияния лекарственных препаратов, и их необходимо учитывать. Именно поэтому мы приняли решение об исследовании ЧКР как ключевого параметра мукоцилиарного клиренса in vitro.

Жизнеспособность и стабильность свойств реснитчатых клеток на протяжении всего времени эксперимента были продемонстрированы посредством сравнения результатов C-до и C-после, которые выявили хорошую корреляцию. Тестируемые растворы были разведены (в соотношении: одна часть тестового раствора на 10 частей клеточной суспензии) в соответствии с предыдущими рекомендациями Deitmer и Scheffler по адаптации условий in vitro к условиям разведения назальных спреев на слизистой оболочке носовой полости in vivo [5]. Изменения ЧКР, вызванные воздействием лекарственных средств, как правило, наблюдаются в течение 5–20 минут после инкубации in vitro [5, 14, 15]. С другой стороны, при условии нормального мукоцилиарного транспорта время контакта лекарственного вещества с эпителием носовой полости in vivo не превышает 20 минут. Поэтому мы проводили измерение ЧКР после 20 минут инкубации, что соответствует рекомендациям других авторов [5, 16], которые считают, что это время адекватно отражает таковое в условиях in vivo.

Значение pH изучаемых лекарственных средств колебалось от 5,5 до 6,8. После разведения в питательной среде для клеточных культур с pH = 7,6 значения pH у растворов, тестируемых in vitro, находились в пределах от 7,2 до 7,5. Известно, что колебания pH в указанных пределах не оказывают влияния на ЧКР мерцательного эпителия [17, 18], так как они соответствуют значению pH слизистой оболочки полости носа in vivo [19].

Хорошо известно, что воздействие бензалкония хлорида (распространенного консерванта) вызывает снижение ЧКР [5, 20]. Бензалкония хлорид входит в состав всех рассмотренных в исследовании лекарственных средств. Поэтому сопоставление эффектов плацебо, содержащего 0,022-процентный раствор бензалкония хлорида, и рассмотренных противоаллергических средств, содержащих такое же (диметиндена малеат) либо меньшее (азеластина гидрохлорид, динатрия кромогликат) количество бензалкония хлорида, представляло особый интерес для количественного определения воздействия трех рассмотренных противоаллергических лекарственных веществ на ЧКР мерцательного эпителия полости носа.

Воздействие лекарственного средства, содержащего динатрия кромогликат, не вызывало большего снижения ЧКР по сравнению с плацебо, что соответствует данным других исследователей [21]. Следовательно, полученные нами результаты подтверждают, что стабилизатор мембран тучных клеток — динатрия кромогликат не должен оказывать нежелательного эффекта на активность ресничек мерцательного эпителия in vitro.

Антагонист H1-рецепторов — диметиндена малеат широко используются для перорального и местного (накожного) применения. Как уже сообщалось, при системном применении он значительно снижает симптомы проявления аллергического ринита [22, 23]. Однако до сих пор ничего не известно о его влиянии на мукоцилиарную систему. В нашем исследовании было установлено, что новый лекарственный препарат, содержащий диметиндена малеат, вызывал слабо выраженное снижение ЧКР, которое было статистически значимым по сравнению с контрольным раствором и статистически незначимым по сравнению с плацебо. Таким образом, существенного влияния диметиндена малеата на активность ресничек мерцательного эпителия носовой полости in vitro не выявлено. Полученные результаты могут способствовать введению в клиническую практику нового лекарственного средства для местного применения, содержащего диметиндена малеат.

Азеластина гидрохлорид является противоаллергическим средством для местного (интраназального) и системного (перорального) применения. Было продемонстрировано наличие у него эффекта антагонизма к H1-рецепторам, также как и прочих противоаллергических воздействий на высвобождение антигениндуцированных медиаторов воспаления и воспалительную клеточную инфильтрацию [24, 25]. В данном исследовании мы оценивали лекарственное средство, содержащее азеластин и предназначенное для интраназального применения. Однако оказалось, что оно значительно снижает активность ресничек мерцательного эпителия, вплоть до полного прекращения движения ресничек в нескольких рассмотренных случаях. В литературе можно найти опубликованные результаты, касающиеся воздействия азеластина на активность ресничек мерцательного эпителия, однако они являются спорными. Так, например, Su и Po обнаружили снижение ЧКР образцов эпителия трахеи крыс, которое наблюдалось после инкубации с подобными концентрациями другого лекарственного средства, содержащего азеластин [14]. В то же время Tamaoki с коллегами наблюдал увеличение ЧКР эпителия биоптатов трахеи человека после орошения их раствором азеластина с концентрацией 10-4 моль/л [15].

В отличие от полученных спорных данных по азеластину, результаты изучения левокабастина — другого антагониста H1-рецепторов, предназначенного для местного лечения аллергических ринитов, показали наличие у него лишь незначительного эффекта снижения активности ресничек мерцательного эпителия in vitro и отсутствие существенного влияния на ВНМЦК in vivo [16].

В заключение следует отметить, что влияние рассмотренных противоаллергических лекарственных средств для интраназального применения на ЧКР мерцательного эпителия носовой полости в условиях in vitro существенно различалось. Наблюдаемые эффекты варьировали от отсутствия снижения активности ресничек мерцательного эпителия до ее значительного угнетения. В клинической практике необходимо учитывать возможное воздействие некоторых противоаллергических лекарственных средств для интраназального применения, например, таких как азеластин, на активность ресничек мерцательного эпителия. Дальнейшие исследования влияния противоаллергических средств для интраназального применения на мукоцилианую активность (in vitro и in vivo) должны внести ясность в этот вопрос. Так как указанные лекарственные вещества широко используются пациентами, страдающими сезонными и хроническими аллергическими ринитами, данные исследования имеют большое значение для обеспечения безопасности пациентов при длительном приеме этих лекарственных средств.

Литература

1. Deitmer T. Physiology and pathology of the mucociliary // Adv Otorhinolaryngol. 1989; 43: 1–143.
2. Sakakura Y. Mucociliary function during experimentally induced rhinovirus infection in man // Ann Otol Rhinol Laryngol. 1974; 82: 203–2ll.
3. Sakakura Y. Ukai K., Majima Y., Murai S. Harada T., Miyoshi Y. Nasal mucociliary clearance under various conditions // Acta Otolaryngol (Stockh). 1983; 96: 167–173.
4. Ohashi Y., Nakai Y., Kihara S., Ikeoka H., Takano H., Imoto T. Ciliary activity in patients with nasal allergies // Eur Arch Otorhinolaryngol. 1985; 242: 141–147.
5. Deitmer T., Scheffler R. The effect of different preparations of nasal decongestants on ciliary beat frequency in vitro // Rhinology. 1993; 31: 151–153.
6. Van de Donk H. J. M., van den Heuvel A. G. M., Zuidema J., Merkus F. W. H. M. The effects of nasal drops and their additives on human nasal mucociliary clearance // Rhinology. 1982; 20: 127–137.
7. Albegger K. Symptomatische Therapie der allergischen Rhinitis // Laryngol Rhinol Otol (Stuttg). 1990, 69: 613–620.
8. Lund V. Seasonal allergic rhinitis — a review of current therapy // Allergy. 1996; 51: 5–7.
9. Meltzer E. O., Storms W. W., Pierson W. E. et al. Efficacy of azelastine in perennial allergic rhinitis; clinical and rhinomanometric evaluation // J Allergy Clin Immunol. 1988; 82: 447–455.
10. Gatspar H., Nolte D., Aurich R. et al. Comparative efficacy of azelastine nasal spray and terfenadine in seasonal and perennial rhinitis // Allergy. 1994; 49: 152–158.
11. Charpin D., Godard P., Garay R. P., Baehre M., Herman D., Michel F. B. A multicenter clinical study of the efficacy and tolerability of azelastine nasal spray in the treatment of seasonal allergic rhinitis: a comparison with oral cetrizine // Eur Arch Otorhinolaryngol. 1995; 252: 455–458.
12. Dalhamn T., Rylander R. Frequency of ciliary beat measured with a photosensitive cell // Nature. 1962; 196: 592–593.
13. Riechelmann H., Hafner B., Mann W. Ziliare Aktivitat und Sekrettransport bei der allergischen Reaktion der N’asenschleimhaut // Allergologie. 1992: 15: 224–228.
14. Su X. Y., Po A. L. The effect of some commercially available antihistamine and decongestant intranasal formulations on ciliary beat frequency // J Clin Pharm Ther. 1993; 18: 219–222.
15. Tamaoki J., Chiyotani A., Sakai N., Takeyama K., Konno K. Effect of azelastine on sulphur dioxide induced impairment of ciliary motility in airway epithelium // Thorax. 1993; 48: 542–546.
16. Merkus F. W., Schusler van Hees M. T. Influence of levocabastine suspension on ciliary beat frequency and mucociliary clearance // Allergy. 1992; 47: 230–233.
17. Van de Donk H. J. M., Zuidema J., Merkus F. W. H. M. The influence of the pH and osmotic pressure upon tracheal ciliary beat frequency as determined with a new photoelectric registration device // Rhinology. 1980; 18: 93–104.
18. Ingels K. J. A. O., Kortmann M. J. W., Nijziel M. R., Graamans K., Huizing E. H. Factors influencing ciliary beat measurements // Rhinology. 1991; 29: 7–26.
19. Breuninger H. Uber das physikalisch-chemische Verhaltcn des Nasenschleims // Arch Klin Exp Ohren Nasen Kehlkopfheilk. 1964; 184: 133–138.
20. Van de Donk H. J. M., Muller-Plantema I. P., Zuidema J., Merkus F. W. H. M. The effects of preservatives on the ciliary beat frequency of chicken embryo tracheas // Rhinology. 1980; 18: 119–133.
21. Van de Donk H. J. M., Zuidema J., Merkus F. W. H. M. The effects of nasal drops on the ciliary beat frequency of chicken embryo tracheas // Rhinology. 1981; 19: 215–230.
22. Horak F., Jager S., Nirnbergcr G., Bergcr U., Andresen L., Vix J. M., Rehn D. Pharmacodynamic dose finding of dimethindene in a sustained release formulation // Arzneimittelforschung. 1993: 43: 1193–1195.
23. Horak F., Jager S., Berger U. et al. Controlled exposure to mite allergen for a dose finding of dimethindene maleate (DMM) // Agents Actions. 1994: 41: C124–126.
24. Ciprandi G., Pronzato C., Passalacqua G. et al. Topical azelastine reduces eosinophil activation and intercellular adhesion molecule-1 expression on nasal epithelial cells: an antiallergic activity // J Allergy Clin Immunol. 1996; 98: 1088–1096.
25. Shirasaki H., Asakura K., Sohma S., Kataura A. Inhibitory effects of azelastine on nasal allergic responses in sensitized guinea pigs // Eur Arch Otorhinolaryngol. 1992; 249: 279–282.

Дж. Альберти
В. Стол

Вестфальский университет им. Вильгельма, Мюнстер, Германия

Контактная информация об авторах для переписки: Dr. Jurgen Alberty, Kardinal-von-Galen-Ring 10, 48129, Munster, Germany