Иммунокомпетентные клетки как мишень для терапии хронического гепатита С

Известно, что в структуре хронических поражений печени доля вирусного гепатита С достигает 40% и более, при котором в среднем через 21 год у 20% больных развивается цирроз печени, а у 8% формируется гепатоклеточная карцинома [24]. Высокая степень персистенции вируса гепатита С (ВГС) и хронизации процесса обусловлена тем, что, несмотря на распознавание вируса иммунной системой хозяина, он ускользает от элиминации из организма почти в 80% случаев [25]. Следует отметить, что в большой степени хроническое поражение печени опосредовано иммунными механизмами, а не прямыми цитопатическими эффектами самого вируса [6].

Несмотря на большое количество проведенных научных исследований и накопленного клинического опыта, проблема лечения гепатита С еще далека от решения. В настоящее время наиболее часто в качестве терапии ВГС-инфекции применяется комбинированное лечение пегилированным интерфероном (ИФН) в сочетании с рибавирином [37]. Следует отметить, что эффективность противовирусной терапии составляет всего 40–80% [19], что диктует необходимость поиска новых путей оптимизации лечения больных хроническим гепатитом С (ХГС).

Как было сказано выше, течение инфекционного процесса и его исходов в большей степени зависит от факторов врожденного и адаптивного иммунитета, что указывает на возможность проведения прицельной иммунотропной терапии ХГС. В связи с этим проблема поиска неизвестных мишеней среди иммунокомпетентных клеток для терапевтического воздействия при ХГС является чрезвычайно актуальной.

Известно, что сама печень является важным органом иммунной системы, который постоянно подвергается воздействию большого количества различных антигенов, таких как патогены, токсины, опухолевые клетки, комменсальные микроорганизмы, белки пищи [36], т. е. печень должна обладать иммунокомпетентностью, контролировать неуместный воспалительный ответ на безвредные антигены, тем самым селективно индуцировать либо иммунный ответ, либо толерантность на антигены. Кроме того, печень является крупнейшим сайтом для удаления CD8

⁺ Т-клеток через антигенопосредованную клеточную гибель [40].

Результатом проникновения ВГС в организм является включение экстренной неспецифической защиты, т. е. врожденного иммунитета. Развитие естественного иммунного ответа тесно связано с функцией моноцитоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток, при этом большую роль играют сигналы, поступающие в эти клетки через Toll-подобные рецепторы (TLR) [14]. Известно, что по уровню экспрессии различных видов TLR можно проводить мониторинг эффективности лечения [39], так как существуют данные, указывающие на то, что у ВГС-инфицированных пациентов уровень TLR-индукции ИФН I типа — альфа и бета (ИФН-альфа и ИФН-бета), а также фактора некроза опухолей (ФНО-альфа) дендритными клетками гораздо ниже, чем у здоровых людей [17]. Кроме того, у этих пациентов дендритные клетки не только нарушают продукцию ИФН-альфа/бета, но и сами не отвечают на ИФН-альфа, а также утрачивают способность к экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости [23]. Безусловно, неадекватная реакция дендритных клеток в самом начале иммунного ответа на ВГС отрицательно сказывается на процессе взаимодействия всех клеток — участников иммунного процесса, в частности, естественных киллеров (ЕК) и ЕК/Т-лимфоцитов (ЕКТ) и Т-лимфоцитов. Успешная противовирусная терапия ХГС увеличивала экспрессию TLR2, TLR4 и TLR9 на Т-клеточных субпопуляциях, однако не регистрировалась у пациентов без стойкого вирусологического ответа на терапию.

Обсуждая роль иммунной системы при ВГС-инфекции, особо следует подчеркнуть ведущее значение пусковых реакций адаптивного противовирусного иммунного ответа, осуществляемых Т-хелперами. Нормальное функционирование иммунной системы строится на балансе Т-хелперов 1 го и 2 го типов (Тh1, Th2), основанном на равноценной продукции регуляторных цитокинов [1]. Большинство исследователей сходятся во мнении, что преимущественное участие цитокинов, продуцируемых Тh2 лимфоцитами, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса при ВГС-инфекции, а Тh1 лимфоцитов — со спонтанным выздоровлением при остром гепатите С и элиминацией возбудителя. В эксперименте было установлено, что усиление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 при отсутствии ИЛ-2 свидетельствует о преимущественной дифференцировке Т-хелперов в направлении Тh2 фенотипа на фоне вирусной персистенции [21]. Важную роль в регуляции баланса Th1/Th2 принадлежит субпопуляции Т-лимфоцитов CD3+/56+ (ЕКТ) [8]. Преобладание Th1 цитокинной продукции (ИЛ-2, ИФН-гамма) поддерживает клеточный иммунный ответ, обеспечиваемый цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) [2].

Оценивая иммунный ответ при ВГС-инфекции в целом, следует подчеркнуть еще несколько обстоятельств. Гуморальный иммунный ответ, связанный с нейтрализующими антителами (АТ), направленными на Е2 вируса, малоэффективен из-за обилия вариантов генетически гетерогенного ВГС. Клеточный иммунный ответ играет более существенную роль в элиминации вируса в ходе острой инфекции, поскольку ассоциирован с полиспецифичностью противовирусных CD4

⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Было установлено, что именно полиспецифичные CD4⁺ и CD8⁺ клетки играют ведущую роль в спонтанном освобождении организма от вируса гепатита С, в частности, ВГС-специфичные CD8⁺ Т-клетки индуцируют апоптоз инфицированных гепатоцитов через Fas/CD95 рецептор [22], а также перфорин/гранзимзависимым путем с участием провоспалительного цитокина ИФН-гамма [38]. Однако у больных с ХГС наблюдается ослабление пролиферативной способности и специфической цитотоксичности CD8+ клеток по сравнению со выздоровевшими пациентами [18].

Персистенция ВГС также взаимосвязана, в первую очередь, c CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточным ответом [16], поскольку в конечном итоге после длительного контакта с вирусом ВГС-специфические Т-клетки теряют способность к иммунному ответу: они или элиминируются, или переходят в состояние клональной анергии, или способствуют росту регуляторных Т-клеток [38].

Взаимодействие между хемокинами и их рецепторами важно для привлечения ВГС-специфичных Т-клеток в печень для контроля инфекции. Когда адаптивный иммунный ответ не справляется с этой задачей, неспецифические цитотоксические Т-клетки без способности контролировать инфекцию также привлекаются в печень, что в конечном итоге приводит к постоянному ее повреждению. Содержание некоторых хемокинов и их рецепторов коррелирует с повреждением печени; уровни CXCL10 (IP-10) и CXCR3 могут помочь в оценке результатов лечения. В связи с этим регуляция хемокинов и их рецепторов может быть будущей мишенью для терапии, чтобы уменьшить воспаление печени и увеличить миграцию специфических цитотоксических Т-клеток в пораженную вирусом печень [35].

Было подтверждено, что механизмы, обеспечивающие высокий уровень вирусных антигенов, связаны с присутствием в крови регуляторных Т-клеток (Treg) и снижением функциональной активности дендритных клеток [7]. В последние годы проводится большое количество исследований по изучению фенотипа и функциональных способностей Treg-клеток при различных патологиях. Treg — это гетерогенная популяция клеток, включающая: классические CD4⁺CD25⁺ субпопуляции, экспрессирующие Foxp3 — транскрипционный фактор, CD4⁺ T-клетки, секретирующие ИЛ-10 или трансформирующий фактор роста бета (ТФР-бета), а также некоторые CD8⁺ Т-клетки, дважды негативные Т-клетки и гамма-дельта-Т-клетки [33]. В частности, при иммуногистохимическом исследовании биоптатов печени больных ХГС, которым ранее не проводилось лечение, было обнаружено увеличение количества CD4⁺FoxP3⁺ Тreg-клеток в несколько раз по сравнению со здоровыми людьми [32].

Установлено, что CD4⁺FoxP3⁺ клетки находились в области некрозовоспалительных изменений и контактировали с CD8⁺ T-клетками, обеспечивая Treg-опосредовательное ингибирование СD8⁺ клеточной пролиферации через межклеточное взаимодействие. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени удалось установить четкую корреляцию между показателями CD8, FoxP3 и ИЛ-10 и четырьмя определенными генными кластерами: CD8 FoxP3, CD8 ИЛ-10, ТФР-бета-10 и ФНО-альфа-ТФР-бета [11]. Интересно, что соотношение FoxP3

⁺/CD8⁺ клеток существенно снижалось на стадии фиброза 3 (по шкале METAVIR) из-за резкого уменьшения количества FoxP3 Treg-клеток [11], приводящего к выраженной активизации иммунной системы, что подтверждают и наши исследования [3]. По-видимому, ВГС-специфичный Treg-ответ c секрецией ИЛ-10 может играть двойную роль при ВГС-инфекции: ослабление эффектов Т-клеток, обеспечивая тем самым вирусную персистенцию при острой инфекции, в то же время препятствуя развитию фиброза при хронической инфекции [31].

Известно, что увеличению количества CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127 low Тreg способствует галектин-9, продуцируемый купферовскими клетками печени, что ингибирует эффекты CD4⁺ клеток и способствует апоптозу ВГС-специфичных ЦТЛ [4].

Оценка субпопуляционного состава Тreg может предсказать результат комбинированной терапии хронического гепатита С: у пациентов с устойчивым вирусологическим ответом регистрируется существенное увеличение Foxp3⁺/CD4⁺ клеток, тогда как у неотвечающих на терапию наблюдается уменьшение Foxp3⁺/CD4⁺ и увеличение CD8⁺/Foxp3⁺ клеток в ответ на прием пегилированного ИФН-альфа и рибавирина [34].

Вероятно, дисфункция иммунной системы связана с появлением иммунодепрессивных клеток, приводящих к уменьшению стимулированных дендритных клеток и ЕК. В связи с этим можно предположить, что лечебные препараты, которые способны заблокировать подавляющие эффекты Treg-клеток и восстановить стимулирующие эффекты дендритных клеток и ЕК, могут затормозить прогрессирование ХГС [37].

С этой точки зрения особого внимания заслуживает патогенетическая роль еще двух категорий клеток, реакции которых относят к проявлениям врожденного иммунитета — ЕК и ЕКТ. В связи с тем что ВГС, благодаря своей гетерогенности, ускользает от вирус-специфического Т- и В клеточного ответа, особый интерес представляют особенности действия этого вируса на ЕК, поскольку роль этих клеток в формировании иммунных процессов в печени особенно велика [28]. С одной стороны, естественные киллеры препятствуют развитию фиброза печени через киллинг-активированные звездчатые клетки и продукцию ИФН-гамма, с другой — ЕК ингибируют регенерацию печени через продукцию ИФН-гамма и киллинг-гепатоциты [29]. Дело в том, что функциональные особенности естественных киллеров связаны как с их субпопуляционным составом, так и с экспрессией активирующих и ингибирующих рецепторов ЕК.

В литературе имеются данные о том, что у больных ХГС по сравнению со здоровыми людьми снижается число ЕК в печени и падает активность этих клеток в периферической крови (главным образом способность к секреции ИФН-альфа), а степень этих отклонений значительно уменьшается после терапии препаратами ИФН-альфа [12].

Таким образом, характеризуя функциональное состояние ЕК при ХГС, исследователи говорят о своеобразной дихотомии этих клеток — росте цитолитической активности и нарушении их секреторных функций, в частности, по продукции ИФН-гамма и ФНО-альфа [26]. Этот факт подтверждается также сведениями о том, что при ХГС фенотип ЕК поляризован в сторону роста экспрессии на поверхности этих клеток рецептора CD107a как маркера дегрануляции в процессе реализации цитотоксических свойств, но не роста ИФН-гамма продукции, при этом ЕК активно экспрессируют TRAIL (ФНО-зависимый лиганд, индуцирующий апоптоз), то есть проявляют склонность к апоптозу [27]. Наши исследования показали, что при ХГС процесс активации ЕК протекает волнообразно и максимально выражен на третьей (предцирротической) стадии (по шкале METAVIR) фиброзных изменений в печени и эта активность носит цитотоксический характер, поскольку на этой же стадии отмечалось резкое падение экспрессии маркера внутриклеточно расположенных цитолитических гранул (СD107 а), т. е. можно предположить, что шло активное их высвобождение [3].

При оценке функционального состояния ЕК следует учитывать то обстоятельство, что эти клетки делятся на две субпопуляции в соответствии с уровнем экспрессии CD56: CD56bright и CD56dim. CD56dim+ клетки населяют селезенку, являются циркулирующими лимфоцитами (более 90% ЕК крови), участвуют в реакциях естественной и антителозависимой цитотоксичности. Субпопуляция CD56bright, главным образом, находится в плотных тканях (печень, матка и др.), содержится в лимфе и составляет менее 10% ЕК крови. Именно эти клетки осуществляют регуляцию иммунного ответа через продукцию цитокинов [10].

При ХГС нарушается баланс между CD56bright и CD56dim субпопуляциями, в частности, в периферической крови наблюдается рост CD56bright ЕК и снижение уровня CD56dim ЕК, нередко отмечают корреляцию уровня CD56dim с вирусной нагрузкой [15]. В отсутствии ИФН-альфа количество активированных CD56dim ЕК значительно снижается, в то время как количество апоптотических CD56dim ЕК растет. Активированные CD56bright и апоптотические CD56bright имеют высокую степень корреляции с уровнем воспаления печени [20]. Также наблюдается высокий уровень экспрессии ингибиторных NKG2A рецепторов на CD56dim клетках, который сохраняется после лечения комбинированной терапией пегилированным ИФН-альфа и рибавирином у пациентов без вирусологического ответа [5].

Значение субпопуляционного состава естественных киллеров при ВГС-инфекции, по мнению Lin A. W., Gonzalez S. A., Cunningham-Rundles S. et al. [9], все-таки связано с субпопуляцией CD56bright, которая в наибольшей степени представлена в печени и в состоянии активации (CD69

⁺) играет значительную роль в индукции воспалительных изменений в этом органе при гепатите С, в то время как CD56dim/CD69+ субпопуляция ЕК с цитолитической активностью имеет значение в защитных реакциях только у пациентов с благоприятным течением инфекции, поддающихся лечению.

ЕКТ — субпопуляция Т-лимфо­цитов, несущих антигенраспознающие рецепторы альфа и бета (ТСRαβ+), которые по рецепторам и свойствам сходны и с Т-лимфоцитами, и с ЕК. Эти клетки по линейным маркерам имеют фенотип CD3⁺CD56⁺, проявляют свойства и той и другой популяции, а также уникальные качества, характеризующие их как отдельную категорию лимфоцитов с определенной биологической ролью [13].

ЕКТ в большом количестве регистрируются в печени человека, в целом, инвариантные ЕКТ регулируют баланс Th1/Th2 путем продукции в разных соотношениях ИФН-гамма или ИЛ-4 и определяют усиление или супрессию иммунного ответа [13]. Основной особенностью ЕКТ является быстрый цитокинный ответ на гликолипиды микроорганизмов. Характер цитокинного профиля, который определяет функциональные способности ЕКТ, связан с субпопуляциями этих клеток. У человека описаны три фенотипических варианта: СD4⁺, CD8⁺, CD4 CD8 или дважды негативные (DN) ЕКТ. CD4⁺ секретируют преимущественно ИЛ-4 и ИФН-гамма. При ХГС эти клетки продуцируют преимущественно ИЛ-13, стимулирующий развитие фиброза печени. CD8

⁺ субпопуляция ЕКТ обладает супрессорными свойствами, а дважды негативные клетки — цитотоксичностью [30].

По нашим данным, развитие фиброза печени во многом связано с функциями ЕКТ, критическое состояние которых также приходится на третью стадию фиброза печени, когда регистрируется выраженная активация иммунной системы, приводящая в итоге к циррозу печени [3]. Встает вопрос: чего же мы можем добиться назначением на этой стадии интерфероновой терапии Еще сильнее простимулировать клетки иммунной системы А хорошо ли это будет для конкретного больного Очевидно, что лечение ХГС должно осуществляться с учетом состояния иммунной системы на определенной стадии болезни, при дальнейшем назначении узконаправленной терапии на определенные иммунокомпетентные клетки.

Глубокое понимание патогенеза ХГС и роли отдельных клеток иммунной системы в этом процессе позволит существенно улучшить терапию ХГС и приблизиться к индивидуальному лечебному подходу.

Научно-исследовательская работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы.

Литература

1. Семененко Т. А. Иммунологические показатели эффективности лечения HCV-инфекции // Вирусные гепатиты. 2005. № 1 С. 3–7.
2. Хаитов Р. М. Иммунология: учебник для студентов медицинских вузов / Р.М. Хаитов. М.:ГЭОТАР Медиа, 2006. 320 с.
3. Шмелёва Е. В. Иммунопрогностические критерии развития цирроза печени как исхода хронического вирусного гепатита С. автореф. дисс... . к-та мед. наук. М., 2009. 24 c.
4. Mengshol John A. A Crucial Role for Kupffer Cell-Derived Galectin-9 in Regulation of T Cell Immunity in Hepatitis C Infection // Published online, 2010, March 4. doi: 10.1371/journal.pone.0009504.
5. Harrison R. J. et al. Association of NKG2A with treatment for chronic hepatitis C virus infection // Clin Exp Immunol. 2010. Vol. 161. № 2. P. 306–314.
6. Bode J. G., Brenndrfer E.D., Hussinger D. Hepatitis C virus (HCV) employs multiple strategies to subvert the host innate antiviral response // Biol. Chem. 2008. Vol. 389. № 10. P. 1283–1298.
7. Boonstra A., Woltman A. M., Janssen H. L. Immunology of hepatitis B and hepatitis C virus infections // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2008. Vol. 22. № 6. P. 1049–1061.
8. Boyton R. J., Altmann D. M. Natural killer cells, killer immunoglobulin-like receptors and human leucocyte antigen class I in disease // Clin. Exp. Immunol. 2007. Vol. 149. № 1. P. 1–8.
9. Lin A. W. et al. CD56(+dim) and CD56(+bright) cell activation and apoptosis in hepatitis C virus infection // Clin. Exp. Immunol. 2004. Vol. 137. № 2. P. 408–416.
10. Fehniger T. A. et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity // Blood. 2003. Vol. 101. P. 3052–3057.
11. Sturm N. et al. Characterization and role of intra-hepatic regulatory T cells in chronic hepatitis C pathogenesis // J Hepatol. 2010. Apr 20. [Epub ahead of print].
12. Dessouki O. et al. Chronic hepatitis C viral infection reduces NK cell frequency and suppresses cytokine secretion: Reversion by anti-viral treatment // Biochem Biophys Res Commun. 2010. Vol. 393. № 2. P. 331–337.
13. Liu T. Y. et al. Distinct subsets of human invariant NKT cells differentially regulate T helper responses via dendritic cells // Eur. J. Immunol. 2008. Vol. 38. № 4. P. 1012–1023.
14. Ebihara T., Matsumoto M., Seya T. HCV and innate immunity // Uirusu. 2008. Vol. 58. № 1. P. 19–26.
15. Bonorino P. et al. Fine characterization of intrahepatic NK cells expressing natural killer receptors in chronic hepatitis B and C // J. Hepatol. 2009. Vol. 51. № 3. P. 458–467.
16. Golden-Mason L, Rosen H. R. Natural killer cells: primary target for hepatitis C virus immune evasion strategies // Liver Transpl. 2006. Vol. 12. № 3. P. 363–372.
17. Krishnadas D. K. et al. Immunomodulation by hepatitis C virus-derived proteins: targeting human dendritic cells by multiple mechanisms // Int Immunol. 2010. Vol. 22. № 6. P. 491–502.
18. Wedemeyer H. et al. Impaired effector function of hepatitis C virus-specific CD8+ T cells in chronic hepatitis C virus infection // J Immunol. 2002. Vol. 169. № 6. P. 3447–3458.
19. Stegmann K. A. et al. Interferon-alpha-induced TRAIL on natural killer cells is associated with control of hepatitis C virus infection // Gastroenterology. 2010. Vol. 138. № 5. P. 1885–1897.
20. Stegmann K. A. et al. Interferon-alpha-induced TRAIL on natural killer cells is associated with control of hepatitis C virus infection // Gastroenterology. 2010. Vol. 138. № 5. P. 1885–1897.
21. Kakimi K. Immune-based novel therapies for chronic hepatitis C virus infection // Hum Cell. 2003. Vol. 16. № 4. P. 191–197.
22. Kanto T., Hayashi N. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection: multifaceted strategies subverting innate and adaptive immunity // Intern. Med. 2006. Vol. 45. № 4. P. 183–191.
23. Kanto T. Virus associated innate immunity in liver // Front. Biosci. 2008. Vol. 13. P. 6183–6192.
24. Lang K., Weiner D. B. Immunotherapy for HCV infection: next steps // Expert Rev Vaccines. 2008. Vol. 7. № 7. P. 915–923.
25. Shuping W. et al. Natural epitope variants of the hepatitis C virus impair cytotoxic T lymphocyte activity // World J Gastroenterol. 2010. Vol. 16. № 16. P. 1953–1969.
26. Oliviero B. et al. Natural killer cell functional dichotomy in chronic hepatitis B and chronic hepatitis C virus infections // Gastroenterology. 2009. Vol. 137. № 3. P. 1151–1160.
27. Ahlenstiel G. et al. Natural Killer Cells are Polarized towards Cytotoxicity in Chronic Hepatitis C in an Interferon-alpha-Dependent Manner // Gastroenterology. 2009. Vol. Sep 9.
28. Wang S. H. et al. Natural killer cells suppress full cycle HCV infection of human hepatocytes // J. Viral. Hepat. 2008. Vol. 15. № 12. P. 855–864.
29. Notas G., Kisseleva T., Brenner D. NK and NKT cells in liver injury and fibrosis // Clin Immunol. 2009. Vol. 130 № 1. P. 16–26.
30. Kenna T. et al. NKT cells from normal and tumor-bearing human livers are phenotypically and functionally distinct from murine NKT cells // J. Immunol. 2003. Vol. 171. № 4. P. 1775–1779.
31. Kaplan D. E. et al. Peripheral virus-specific T-cell interleukin-10 responses develop early in acute hepatitis C infection and become dominant in chronic hepatitis // J Hepatol. 2008. Vol. 48. № 6. P. 903–913.
32. Ward S. M. et al. Quantification and localisation of FOXP3+ T lymphocytes and relation to hepatic inflammation during chronic HCV infection // J Hepatol. 2007. Vol. 47. № 3. P. 316–324.
33. Alatrakchi N., Koziel M. Regulatory T cells and viral liver disease // J Viral Hepat. 2009. Vol. 16. № 4. Р. 223–229.
34. Akiyama M. et al. Relationship between regulatory T cells and the combination of pegylated interferon and ribavirin for the treatment of chronic hepatitis type C // Intervirology. 2010. Vol. 53. № 3. P. 154–160.
35. Larrubia Juan R. et al. Role of chemokines and their receptors in viral persistence and liver damage during chronic hepatitis C virus infection // World J Gastroenterol. 2008. Vol. 14. № 47. P. 7149–7159.
36. Rosen H. R. Transplantation immunology: what the clinician needs to know for immunotherapy // Gastroenterology. 2008. Vol. 134. P. 1789–1801.
37. Salem M. L, El-Demellawy M., El-Azm A. R. The potential use of Toll-like receptor agonists to restore the dysfunctional immunity induced by hepatitis C virus // Cell Immunol. 2010. Vol. 262. № 2. P. 96–104.
38. Spengler U., Nattermann J. Immunopathogenesis in hepatitis C virus cirrhosis // Clin. Sci. Lond. 2007. Vol. 112. № 3. P. 141–155.
39. Hammond T. et al. Toll-like receptor (TLR) expression on CD4+ and CD8+ T-cells in patients chronically infected with hepatitis C virus // Cell Immunol. 2010. Vol. 264. № 2. P. 150–155.
40. Keating R. et al. Virus-specific CD8+ T cells in the liver: armed and ready to kill // J Immunol. 2007. Vol. 178. P. 2737–2745.