Взаимосвязь между симпатической нервной системой и эндотелином-1 в капиллярном кровотоке у больных ишемической болезнью сердца – значение GNB3 C825T полиморфизма

Кардиоваскулярный гомеостаз в организме человека обеспечивается тремя прессорными системами: симпатической нервной системой (СНС), ренин-ангиотензин-альдостероновой системой (РААС) и системой эндотелина.

Регуляция сосудистого тонуса эндотелием осуществляется путем образования и высвобождения им вазодилататорных и вазоконстрикторных субстанций, самой мощной из которых является эндотелин-1 (ЭТ-1) [1]. ЭТ-1 в фармакологических и патофизиологических условиях вызывает системную, почечную и коронарную вазоконстрикцию, реализуя свои биологические эффекты путем связывания со специфическими рецепторами: ЭТ_А- и ЭТ_В-рецепторами [2]. ЭТ

_А-рецепторы обнаруживаются преимущественно в гладкомышечных клетках сосудов и участвуют в передаче вазоконстрикторных митогенных эффектов ЭТ-1. ЭТ_В-рецепторы локализованы в эндотелиальных клетках, где вызывают эндотелийзависимую вазодилатацию, способствуя высвобождению простациклина и оксида азота (NO), и в меньшей степени ЭТ_В-рецепторы, присутствующие в гладкой мускулатуре, опосредуют вазоконстрикторный эффект [2]. Вазоконстрикторный эффект ЭТ-1 приводит к повышению периферического сосудистого сопротивления, а также сопротивления сосудов сердца, мозга и почек, вследствие чего ЭТ-1 играет важную роль в патогенезе различной сердечно-сосудистой патологии, к числу которой принадлежит и ишемическая болезнь сердца (ИБС) [2, 3]. Исследования содержания ЭТ-1 в плазме крови и специфической иммунной реактивности к ЭТ-1 в аорте человека, пораженной атеросклерозом, свидетельствуют об участии ЭТ-1 в развитии ИБС и ее осложнений [4].

К настоящему времени накоплено достаточное количество доказательств в пользу гиперактивности СНС при ИБС. Избыточное высвобождение катехоламинов, к числу которых принадлежит и норадреналин (НА), индуцирует ишемию вследствие рефлекторной тахикардии и коронарной вазоконстрикции [5].

Однако существуют немногочисленные данные о механизмах взаимодействия СНС и сосудистого эндотелия. Так, у крыс введение ЭТ-1 в центральные отделы головного мозга в дозах, не вызывающих повышения артериального давления (АД), приводило к увеличению плазменной концентрации НА и как следствие возникновению периферической вазоконстрикции [6]. С другой стороны, стимуляция почечных нервов с целью искусственной стимуляции симпатической гиперактивности снижала образование NO в связи с нарушением синтеза эндотелиальной NO-синтетазы [5].

Результаты вышеописанных экспериментов подтверждают и исследования у человека. In vitro сокращение гладкомышечных клеток сосудов, опосредованное активацией a-адренорецепторов, усиливается на фоне подавления эндотелием синтеза NO [7]. Рабочей группой под руководством R. R. Wenzel in vivo было установлено, что агонисты адренорецепторов стимулируют эндотелиальные a-адренорецепторы, что приводит к высвобождению NO и других вазодилататоров [8]. Данный механизм взаимодействия может иметь определенное значение в объяснении патогенетических связей при ИБС и обусловливать терапевтическую тактику.

Известно, что ЭТ-1 как один из основных стимуляторов клеточной гипертрофии передает сигнал внутрь клетки через G-белок-связанные рецепторы. G-протеин (guanine nucleotide binding regulatory protein) представляет собой гетеротример, состоящий из трех субъединиц: а, b, g [9]. G-белки экспрессируются во всех клетках человека и вовлекаются в передачу информации от рецептора к внутриклеточным исполнительным системам. Это явилось теоретическим обоснованием гипотезы о роли G-белка в особенностях гипертрофического ответа при кардиоваскулярной патологии [10]. Исследуемый ген GNB3 кодирует β3 субъединицу G-белка. Полиморфизм в 9 экзоне в позиции 825 приводит к альтернативному сплайсингу и синтезу укороченного варианта G-белка. Т-аллель по 825 позиции у больных артериальной гипертонией связан с повышением пролиферативной активности [11, 12]. Теоретическим обоснованием возможной связи мутации гена G-белка и гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ) является увеличение активности Na-H

⁺-обмена, которое ассоциировано с ГЛЖ [13]. Так, в группе здоровых добровольцев в условиях in vivo более выраженная вазоконстрикция, обусловленная локальным введением ЭТ-1, НА и ангиотензина II в периферическом кровообращении, регистрировалась у носителей Т-аллеля GNB3 гена [14].

Все вышеописанное послужило основанием для исследования влияния блокады ЭТ-рецепторов на ЭТ-1- и НА-индуцированную вазоконстрикцию в периферическом кровотоке и изучения зависимости генетических факторов с регуляцией сосудистого тонуса у больных ИБС.

Цель исследования — оценить влияние блокады ЭТ-рецепторов на вазоконстрикцию, вызываемую ЭТ-1 и НА в капиллярном кровообращении у больных с ИБС и установить взаимосвязь с GNB3 C825T полиморфизмом.

Материалы и методы исследования

Исследование двойное слепое, рандомизированное выполнено согласно критериям Хельсинской декларации по этике. В исследование включены 36 больных с ИБС (20 мужчин и 16 женщин) среднего возраста 60 ± 2 года и 15 некурящих, практически здоровых лиц контрольной группы, сопоставимых по возрасту и полу. Длительность течения ИБС в среднем составляла 9,6 ± 0,6 года. Основанием для включения больных в исследование было наличие клинических признаков в виде приступов стенокардии и данных дополнительных методов исследования, подтверждающих диагноз ИБС. Критериями исключения служили тяжелая артериальная гипертензия, сахарный диабет, хроническая недостаточность кроообращения IIA-стадии и выше, заболевания печени и почек в стадии обострения.

Для оценки изменений периферической микроциркуляции мы использовали лазерную допплерографию с применением аппарата (Moor LDI V3.0 Axminster, Devon, Великобритания), в основе работы которого лежит принцип изменения скорости движущегося объекта (эритроцита) путем определения допплеровского изменения частоты зондирующего гелионеонового лазера длиной волны 632,8 нм. За единицу перфузии принимали величину потока эритроцитов в единицу времени через единицу объема ткани (PU). На фоне внутрикожного введения в предплечье обследуемого методом двойной инъекционной техники субстанций ЭТ-1 в концентрациях (10^-12, 10^-14, 10^-16 моль), НА — (10^-12, 10^-14, 10^-16 моль), селективного антагониста ЭТ_А-рецепторов BQ123 (10^-8 моль) и селективного антагониста ЭТ_В-рецепторов BQ788 (10^-8 моль) измеряли показатели микроциркуляции в покое и на каждой 2,5 мин в течение 30 минут. В качестве контроля служили показатели перфузии после введения изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) [15]. С целью оптимизации получаемых результатов исследование проводилось в положении лежа на спине после 30-минутной фазы относительного покоя, в едином тепловом режиме помещения (22 ± 1°C), в одно и то же время суток. В день исследования исключался прием нитратов, спазмолитиков и вазоактивных препаратов.

Данный метод отличается высокой воспроизводимостью результатов в стандартных условиях (0,08 ± 0,04%) [16].

Всем больным также проводили генотипирование по GNB3 C825T полиморфизму.

Геномная ДНК выделялась из лейкоцитов периферической крови согласно стандартному методу, и в ходе полимеразной цепной реакции амплифицировался фрагмент гена GNB3, содержащий изучаемый полиморфный вариант. Идентификацию генотипа определяли посредством рестрикционного анализа (рестрикционная эндонуклеаза). В группе обследуемых больных регистрировались 19 человек — носителей СС-генотипа, 11 человек — СТ-генотипа и 6 человек — 825Т-аллеля полиморфизма GNB3. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы GraphPad Prism V.5 (США) параметрическими методами. Определялись величина средней (M) и стандартное отклонение (m) различий между группами. Различия считали достоверными при р < 0,05. Для оценки взаимосвязи показателей перфузии использовали тест ANOVA с факторами «время» и «субстанция».

Результаты исследования и обсуждение

ЭТ-1 вызывает в кожной микроциркуляции дозозависимую вазоконстрикцию периферических сосудов, которая достоверно более выражена у больных ИБС в сравнении с контрольной группой (средние максимальные значения: -213 ± 34 PU vs. -76 ± 16 PU, р = 0,03 соответственно, см. рис. 1).

На фоне локального введения селективного антагониста BQ123 ЭТ

_А-рецепторов регистрировалась вазодилатация, которая в меньшей степени была выражена в группе больных ИБС в сравнении с группой практически здоровых (средние максимальные значения: +112 ± 18 PU vs. +256 ± 24 PU, р < 0,0001 соответственно, см. рис. 2). Однако вазодилатация, опосредованная действием антагониста ЭТ_В-рецепторов BQ788, достоверно сильнее в группе больных, чем в контрольной группе (средние максимальные значения: +336 ± 24 PU vs. +29 ± 8 PU, р < 0,0001 соответственно, см. рис. 2).

BQ123 ингибирует вазоконстрикцию, вызываемую ЭТ-1, в сравнении с одним ЭТ-1 в группе больных ИБС и опосредует вазодилатацию (BQ123+ ЭТ-1/ ЭТ-1: -10 ± 5 PU vs. 183 ± 34 PU, р < 0,001 соответственно, рис. 3а). В группе больных ИБС BQ788 достоверно снижает ЭТ-1-зависимую вазоконстрикцию в сравнении с одним ЭТ-1 (BQ788+ ЭТ-1/ЭТ-1: -81 ± 14 PU vs. -197 ± 52 PU, р = 0,04 соответственно, рис. 3б), тогда как в группе практически здоровых статистически достоверных различий между действием блокатора ЭТ_В-рецепторов на ЭТ-1 в сравнении с ЭТ-1 не выявлено (BQ788+ ЭТ-1/ЭТ-1: -69 ± 9 PU

vs. -77 ± 15 PU, р = 0,88 соответственно).

В ходе исследования мы оценивали также влияние антагонистов ЭТ-рецепторов на НА — как медиатор СНС — в капиллярном кровотоке у больных ИБС. Установлено, что локальное введение НА потенцирует вазоконстрикцию, которая в большей степени выражена в группе больных ИБС (средние максимальные значения: -89 ± 12 PU vs. -36 ± 9 PU, р = 0,0014 соответственно, см. рис. 4).

На фоне введения BQ788 регистрировалось снижение НА-зависимой вазоконстрикции у больных ИБС в сравнении с одним НА (BQ788 + НА/НА: -13 ± 7 PU vs. -89 ± 12 PU, р < 0,001 соответственно, см. рис. 5б), однако селективная блокада ЭТА-рецепторов достоверного влияния на состояние периферического кровотока не оказывала (BQ123 + НА/НА: -74 ± 7 PU vs. -89 ± 12 PU, р = 0,30 соответственно, см. рис. 5а). В контрольной группе эффект блокады ЭТА-рецепторов был обратным и выражался в снижении вазоконстрикции, опосредованной НА (BQ123 + НА/НА: 10 ± 5 PU

vs. -36 ± 9 PU, р = 0,004 соответственно), а на фоне введения блокатора ЭТ_В-рецепторов достоверных изменений перфузии выявлено не было (BQ788 + НА/НА: -21 ± 8 PU vs. -36 ± 9 PU, р = 0,34 соответственно, см. рис. 5б).

В ходе исследования мы выявили ассоциацию между GNB3 С825Т полиморфизмом и особенностями вазоконстрикторного эффекта на фоне локального действия ЭТ-1 и НА. Более выраженная периферическая вазоконстрикция регистрировалась у больных, носителей 825Т-аллеля полиморфизма GNB3 в сравнении с СС-генотипом (СТ/ТТ vs. СС для ЭТ-1: -200 ± 27 PU vs. -122 ± 15 PU, р = 0,02 соответственно; СТ/ТТ vs. СС для НА: -132 ± 12 PU vs. -67 ± 11 PU, р < 0,001 соответственно, см. рис. 6).

Результаты наших исследований показывают, что блокада ЭТ_А-рецепторов у больных ИБС подавляет вазоконстрикцию и вызывает расширение периферических сосудов, что способствует усилению высвобождения NO. С этой точки зрения использование препаратов, непосредственно влияющих на содержание ЭТ-1, может быть одним из способов локальной и системной нормализации функции эндотелия у больных ИБС. Подтверждением тому служат немногочисленные результаты исследований терапии блокаторами ЭТ-рецепторов. У крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью на фоне кратковременного (до 2 нед) и длительного (до 9 мес) применения бозентана и антагониста ЭТ

_А-рецепторов FR139317 констатировалось улучшение гемодинамики, ремоделирования и сократительной способности миокарда левого желудочка [17, 18]. Исследования рабочей группы под руководством R. R. Wenzel по изучению влияния селективной блокады ЭТ_А-рецепторов на эндотелиальную функцию у пациентов с атеросклерозом и у здоровых показали, что терапия антагонистами ЭТ_А-рецепторов положительно влияет на состояние функции эндотелия, повышая эндотелийзависимую дилатацию [19], снижает периферическое сопротивление и вызывает увеличение диаметра коронарных артерий в дистальных сегментах на 10% [6, 20].

Особый интерес с точки зрения практической значимости представляют результаты наших исследований по изучению влияния блокады ЭТ-рецепторов на вазоконстрикцию, индуцированную НА в капиллярном кровотоке у больных ИБС. Селективная блокада ЭТ_В-рецепторов ингибировала не только ЭТ-1-зависимую вазоконстрикцию, но и вазоконстрикцию, индуцированную НА в периферическом кровообращении, что указывает на синергетический эффект комбинации антагонистов рецепторов ЭТ и терапевтических режимов, приводящих к подавлению активности СНС. Проведенные нами ранее исследования у здоровых лиц показали, что ЭТ-1 потенцирует в капиллярах вазоконстрикторный эффект, обусловленный НА, а введение BQ788 приводит к подавлению вазоконстрикции в ответ на действие НА [21]. Данный феномен у практически здоровых мы регистрировали не только на уровне локального сосудистого русла, но и на фоне системных инфузий НА и BQ123, и установили, что антагонист ЭТ-1 снижает гемодинамические эффекты, обусловленные активацией СНС в организме [22, 23]. Однако до сих пор остается неясным механизм взаимодействия СНС и гладкомышечных ЭТ

_В-рецепторов у больных ИБС. Возможно, эндотелиальная дисфункция у таких больных является одним из факторов, потенцирующим вазоконстрикторное действие ЭТВ-рецепторов по механизму up-regulation.

Выявление и анализ ассоциации полиморфизмов генов, кодирующих различные регуляторные белки при ИБС, выяснение их роли в формировании генетической предрасположенности имеет прогностическое значение, позволяет выявить факторы риска и повысить терапевтическую эффективность у таких больных. Более выраженная вазоконстрикция, индуцированная ЭТ-1 и НА, выявлена у больных с СТ/ТТ-генотипом: в связи с этим носители 825Т-аллеля GNB3 С825Т-полиморфизма входят в группу риска развития ИБС. Полученные нами результаты подтверждают и данные о генетически детерминированных различиях ЭТ-1-зависимой вазоконстрикторной реакции у здоровых добровольцев на фоне антагониста α1-адренорецепторов доксацозина. Блокада постсинаптических α1-адренорецепторов приводила к подавлению вазоконстрикторного действия ЭТ-1 в большей степени у гетерозиготных пробандов, чем у носителей СС-генотипа, что еще раз постулирует нашу гипотезу о наличии ассоциации выраженности вазоконстрикторного эффекта медиаторов прессорных систем от GNB3 С825Т-полиморфизма [23, 24]. Так, в другом плацебоконтролируемом исследовании селективный антагонист ЕТА-рецепторов дарузентан в течение 24 ч достоверно снижал плазменную концентрацию ЭТ-1 и НА, причем этот эффект был ярче выражен у здоровых носителей СТ/ТТ-генотипа [25].

Актуальным представляется и изучение влияния антагонистов эндотелина на медиаторы РААС при ИБС, чему посвящена вторая часть нашего исследования. Таким образом, блокада эндотелиновых рецепторов может рассматриваться в качестве потенциального метода комбинированной терапии в сочетании с антагонистами СНС и РААС у больных ИБС, а особенности выраженности вазоконстрикторного ответа на ЭТ-1 и НА от генетического статуса могут прогнозировать в дальнейшем успех этой терапии.

Выводы

1. ЭТ-1 и НА вызывают дозозависимую вазоконстрикцию в капиллярном кровотоке у больных ИБС, которая достоверно выраженнее в сравнении с группой практически здоровых.
2. Селективный антагонист ЭТВ-рецепторов BQ788 снижает, а селективный антагонист ЭТА-рецепторов BQ123 подавляет ЭТ-1-индуцированную вазоконстрикцию, вызывая вазодилатацию в периферической микроциркуляции у больных ИБС.
3. Блокада ЭТВ-рецепторов ингибирует вазоконстрикцию, индуцированную НА у больных ИБС.
4. Более выраженная вазоконстрикция, опосредованная ЭТ-1 и НА в периферическом кровотоке, выявлена у больных ИБС с СТ/ТТ-генотипом. Лица, носители 825Т-аллеля полиморфизма GNB3, входят в группу риска развития ИБС.

Литература

1. Yanagisawa M., Kurihara H., Kimura S., Tomobe Y., Kobayashi M., Mitsui Y., Yazaki Y., Goto K., Masaki T. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells // Nature, 1988; 332(6163): 411–5.
2. Miyauchi T., Masaki T. Pathophysiology of endothelin in the cardiovascular system // Annu Rev. Physiol., 1999; 61: 391–415.
3. Kiely D. G.,Cargill R. I.,Struthers A. D., Lipworth B. J. Cardiopulmonary effects of endothelin-1 in man // Cardiovasc Res., 1997. 33(2): 378–86.
4. Sutherland A. J., Nataatmadja M. I., Walker P. J., Cuttle L., Garlick R. B., West M. J. Vascular remodeling in the internal mammary artery graft and association with in situ endothelin-1 and receptor expression // Circulation, 2006; 113(9): 1180–8.
5. Wenzel R. R., Bruck H., Noll G., Schafers R. F., Daul A. E., Philipp T. Antihypertensive drugs and the sympathetic nervous system // J. Cardiovasc. Pharmacol., 2000. 35(7 Suppl 4): S43–52.
6. Haynes W. G., Ferro C. J., O’Kane K. P., Somerville D., Lomax C. C., Webb D. J. Systemic endothelin receptor blockade decreases peripheral vascular resistance and blood pressure in humans // Circulation, 1996; 93(10): 1860–70.
7. Cocks T., Angus J. Endothelium-dependent relaxation of coronary arteries by noradrenaline and serotonin // Nature, 1983; 305: 627–30.
8. Wenzel R. R., Ruthemann J., Bruck H., Schafers R. F., Michel M. C., Philipp T. Endothelin-A receptor antagonist inhibits angiotensin II and noradrenaline in man // Br. J. Clin. Pharmacol., 2001. 52(2): 151–7.
9. Zhu H., Wang X., Lu Y., Poola J., Momin Z., Harshfield G. A., Snieder H., Dong Y. Update on G-protein polymorphisms in hypertension // Curr. Hypertens. Rep., 2006. 8(1): 23–9.
10. Michalsen A., Knoblauch N. T., Lehmann N., Grossman P., Kerkhoff G., Wilhelm F. H., Moebus S., Konstantinides S., Binder L., Heusch G., Siffert W., Budde T., Dobos G. J. Effects of lifestyle modification on the progression of coronary atherosclerosis, autonomic function, and angina–the role of GNB3 C825T polymorphism // Am. Heart. J., 2006. 151(4): 870–7.
11. Bagos P. G., Elefsinioti A. L., Nikolopoulos G. K., Hamodrakas S. J. The GNB3 C825T polymorphism and essential hypertension: a meta-analysis of 34 studies including 14,094 cases and 17,760 controls // J. Hypertens., 2007. 25(3): 487–500.
12. Danoviz M. E., Pereira A. C., Mill J. G., Krieger J. E. Hypertension, obesity and GNB 3 gene variants // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2006. 33(3): 248–52.
13. Hayakawa T., Takamura T., Abe T., Kaneko S. Association of the C825T polymorphism of the G-protein beta3 subunit gene with hypertension, obesity, hyperlipidemia, insulin resistance, diabetes, diabetic complications, and diabetic therapies among Japanese // Metabolism, 2007. 56(1): 44–8.
14. Wenzel R. R., Siffert W., Bruck H., Philipp T., Schafers R. F. Enhanced vasoconstriction to endothelin-1, angiotensin II and noradrenaline in carriers of the GNB3 825T allele in the skin microcirculation // Pharmacogenetics, 2002. 12(6): 489–95.
15. Wenzel R. R. Minimal invasive in vivo pharmacology: news from a new method holding promise in nephrology related research // Nephrol. Dial. Transplant., 1997. 12: 649–651.
16. Rushentsova U., Saez A. M., Mosel F., Nurnberger J., Gossl M., Mitchell A., Schafers R. F., Philipp T., Wenzel R. R. Laser Doppler imager (LDI) scanner and intradermal injection for in vivo pharmacology in human skin microcirculation: responses to acetylcholine, endothelin-1 and their repeatability // Br. J. Clin. Pharmacol., 2005. 59(5): 511–9.
17. Kalra P. R., Moon J. C., Coats A. J. Do results of the ENABLE (Endothelin Antagonist Bosentan for Lowering Cardiac Events in Heart Failure) study spell the end for non-selective endothelin antagonism in heart failure? Int J Cardiol, 2002. 85(2-3): 195–7.
18. Mulder P., Boujedaini H., Richard V., Derumeaux G., Henry J. P., Renet S., Wessale J., Opgenorth T., Thuillez C. Selective endothelin-A versus combined endothelin-A/endothelin-B receptor blockade in rat chronic heart failure // Circulation, 2000. 102(5): 491–3.
19. Schafers R. F., Nurnberger J., Herrmann B., Wenzel R. R., Philipp T., Michel M. C. Adrenoceptors mediating the cardiovascular and metabolic effects of alpha-methylnoradrenaline in humans // J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999. 289(2): 918–25.
20. Kirchengast M., Luz M. Endothelin receptor antagonists: clinical realities and future directions // J. Cardiovasc. Pharmacol., 2005. 45(2): 182–91.
21. Gossl M., Mitchell A., Lerman A., Opazo Saez A., Schafers R. F., Erbel R., Philipp T., Wenzel R. R. Endothelin-B-receptor-selective antagonist inhibits endothelin-1 induced potentiation on the vasoconstriction to noradrenaline and angiotensin II // J. Hypertens., 2004. 22(10): 1909–16.
22. Mitchell A., Rushentsova U., Nurnberger J., Siffert W., Schafers R., Philipp T. Endothelin- and angiotensin II-antagonism inhibit systemic hemodynamic response to exogenous noradrenaline // J. Hypertension., 2004. 23(2): 174.
23. Mitchell A., Rushentsova U., Nurnberger J., Siffert W., Schafers R., Philipp T. Effects of endothelin-A-receptor-antagonism on systemic hemodynamic responses to exogenous noradrenaline-associations with the GNB3 C825T-polymorphism // J. Hypertension, 2005. 23(2): 302.
24. Mitchell A., Ruzhentsova U., Nurnberger J., Schafers R. F., Philipp T., Wenzel R. R. The angiotensin II-receptor antagonist valsartan and the alpha-1-receptor antagonist doxazosin inhibit endothelin-1-induced vasoconstriction in the skin microcirculation in man in vivo — influence the GNB3 C825T-polymorphism. J. Hypertension, 2005. 23(2): 303.
25. Mitchell A., Rushentsova U., Luckebergfeld B., Buhrmann S., Nurnberger J., Siffert W., Schafers R. F., Philipp T., Wenzel R. R. Effects of systemic endothelin A receptor antagonism in various vascular beds in men: in vivo interactions of the major blood pressure-regulating systems and associations with the GNB3 C825T polymorphism // Clin. Pharmacol. Ther., 2004. 76(5): 396–408.

У. Ю. Руженцова