Диагностические тест-системы для практикующего врача (серия “НикоКард”)

I.

Тест-система “НикоКард — СРБ”. Одним из главных индикаторов воспаления у человека является С-реактивный белок (СРБ). СРБ — уникальный маркер острофазного ответа организма и степени его выраженности, он является самым чувствительным (увеличение в 20-100 раз, в отдельных случаях в 1000 раз) и самым быстрым (в первые 6-8 часов) показателем какого-либо повреждения [5].

Для адекватного количественного определения СРБ в сыворотке используются как сложнейшие радиоиммунологические, турбидиметрические, нефелометрические, иммуноферментные методы, так и “простая” радиальная иммунодиффузия [1, 2]. Для их реализации требуется длительная пробоподготовка и проведение сложных анализов, а также специальное оборудование и квалифицированный персонал. В то же время для практикующего врача (например, терапевта на приеме) из-за скорости развития многих заболеваний, при которых важно определение СРБ, возникает необходимость в быстром, легко интерпретируемом, безынструментальном и количественном тесте, пригодном для работы как с сывороткой/плазмой, так и с цельной кровью.

Этим требованиям, по нашему мнению, соответствует диагностическая система “НикоКард — СРБ” (“Никомед-Диагностик”, Норвегия) [9].

Тест “НикоКард — СРБ” работает по иммунометрическому/иммунофильтрационному принципу и состоит из: 1) кроверазводящей и лизирующей (для цельной крови) жидкости; 2) 4 или 8 карточек с шестью отверстиями, содержащими специфические моноклональные антитела против СРБ, иммобилизированные на порах мембраны, которая расположена на абсорбирующей бумаге, и 3) СРБ-специфических моноклональных антител, конъюгированных с ультрачастицами коллоидного золота.

Для забора крови из пальца используют стеклянные капилляры, предварительно обработанные антикоагулянтом (цитратом, гепарином или ЭДТА) и высушенные в сушильном шкафу. Полученную кровь разводят реагентом (25 мкл к 1000 мкл), тщательно перемешивают и выдерживают 40-60 сек для лизиса клеток. Затем 25 мкл разведенного образца крови вносят в одно из отверстий пористой мембраны, и после ее полной сорбции наносят по очереди каплю коньюгата и затем промывающего раствора для удаления непрореагировавших компонентов. Стойкое пурпурно-красное окрашивание диаметром 3,5 мм появляется сразу же, если проба содержала СРБ (5-10 мг/л). Концентрацию СРБ можно определить полуколичественно визуально. Быстрое и точное определение концентрации СРБ в мг/л осуществляется с помощью универсального портативного денситометра “НикоКард — Ридер”. Вся процедура анализа обычно длится 2-3 мин.

У здоровых индивидуумов уровень сывороточного СРБ обычно ниже 5-10 мг/л. Повышенные концентрации СРБ отмечаются через 6-12 часов после начала воспалительной реакции и достигают максимальных значений в пределах 48-72 часов. СРБ имеет относительно короткий период полужизни (1-2 дня) и обычно возвращается к норме через 5-10 дней после начала воспаления, поэтому быстрота и точность его определения имеют существенное значение для постановки и уточнения диагноза. Например, для дифференциальной диагностики между вирусной и бактериальной пневмониями, бронхитами и другими инфекционными состояниями. Кроме того, измерение уровня СРБ с помощью набора “НикоКард — СРБ” непосредственно на приеме у врача позволяет быстро решить вопрос о назначении (или неназначении) того или иного вида лечения: антибиотиков при бактериальной пневмонии или бактериальном обострении хронического бронхита и бронхиальной астмы, либо бронходилятаторов или антиастматического лечения при вирусных инфекциях дыхательного тракта. При этом следует учитывать, что показатели СРБ при бактериальных инфекциях увеличиваются быстрее и выглядят значительнее, чем при вирусных, и остаются на повышенном уровне больше недели в случае, если антибактериальная терапия не применялась [8].

Таким образом, диагностическая система “НикоКард — СРБ” позволяет быстро (в течение 2-3 мин) и точно (количественно с помощью “НикоКард — Ридер”) оценить наличие воспаления и степень его выраженности, отличить бактериальные инфекции от вирусных, выбрать адекватное лечение воспаления (антибиотики, стероиды, противовоспалительные средства) и контролировать сам процесс лечения. Тест-система показывает хорошую корреляцию с такими широко распространенными лабораторными методами исследования, как турбидиметрия, нефелометрия и иммуноферментный анализ [9], но значительно превосходит их по эргоемкости, т. е. простоте, экономичности и эффективности.

II.

Тест-система “НикоКард — Д-димер”. Д-димер — один из конечных растворимых продуктов расщепления фибрина [4]. Повышенные уровни Д-димера в плазме свидетельствуют о чрезмерных количествах образовавшегося в сосудистой системе фибрина. При возникновении фибринового сгустка активизируются также фибринолитические процессы, которые начинаются с превращения плазминогена в плазмин в присутствии тканевого активатора плазминогена (тАП) и ионов кальция (см. рис.). Плазмин расщепляет полимеризированный фибрин, при этом соседние Д-домены ковалентно перекрестно сшиваются с образованием Д-димера, имеющего специфичные неоантигенные детерминанты [7].

Повышающиеся концентрации в плазме Д-димера указывают на продолжающийся фибринолитический процесс и являются ключевым показателем тромботического состояния при тромбозе глубоких вен, легочной тромбоэмболии, артериальной тромбоэмболии и диссеминированном внутрисосудистом свертывании. Определять Д-димер следует также при ранней диагностике фибринолитических процессов (претромботический риск), в мониторинге при тромболитической терапии, при беременности (послеродовой период), злокачественных новообразованиях и хирургических вмешательствах.

Тест-система “НикоКард — Д-димер” аналогична системе “НикоКард — СРБ” и построена на том же иммунометрическом и иммунофильтрационном принципе с использованием моноклональных антител, конъюгированных с золотом в качестве индикатора. Антитела не дают перекрестных реакций с фибриногеном и другими продуктами деградации фибрина. Ход определения Д-димера в техническом плане принципиально не отличается от тестов по системе “НикоКард — СРБ”. Необходимо всего 50 мкл цитратной плазмы, свободной от тромбоцитов, которая вносится в одно из отверстий пористой мембраны с моноклональными антителами против Д-димера. Пурпурно-розовое окрашивание полуколичественно оценивается визуально, а количественно регистрируется портативным денситометром “НикоКард — Ридер” в диапазоне 0,25 — 10 мг/л. Время определения 2-3 мин. Нормальные значения ниже 0,5 мг/л. Очевидно, что тест-система “НикоКард — Д-димер” объединяет в себе скорость и простоту латексных методов определения Д-димера с аналитическим качеством и чувствительностью иммуноферментных методов [4].

III.

Тест-система “НикоКард — HbA1C”. Количество гликозилированного гемоглобина (HbA1C) в крови — важный показатель долговременного контроля за течением диабета и эффективностью его лечения.

Известно, что белки, в том числе гемоглобин, при длительном выдерживании в растворе, содержащем глюкозу, необратимо присоединяют ее остатки за счет химических (неэнзиматических) процессов [2]. Чем выше концентрация глюкозы в растворе и чем продолжительнее инкубация, тем больший процент молекул гемоглобина гликозилируется. Поэтому HbA1C характеризует средний уровень концентрации глюкозы в крови за время полужизни молекулы гемоглобина (3-4 мес.). Лечение диабета проводится лекарствами, понижающими содержание глюкозы в крови лишь на ограниченный промежуток времени, и очень важно подобрать схему лечения со стойкой нормализацией гликемии. Исследование HbA1C оказывается ценным лабораторным показателем, характеризующим некоторый средний уровень глюкозы на протяжении длительного промежутка времени. Количество HbA1C выражается в молярных процентах (количество остатков моносахарида на 100 молекул гемоглобина).

Для определения HbA1C разработано много способов, включающих различные виды хроматографии, электрофорез и колориметрические методы [3]. Наиболее точные из них хроматографические, но они трудоемки и требуют специальной аппаратуры и реактивов.

Тест-система “НикоКард — HbA1C” лишена этих недостатков и позволяет быстро, точно и воспроизводимо измерять уровень HbA1C в крови в присутствии пациента. Метод основан на специфическом химическом связывании искуственно синтезированного зонда (борная кислота, коньюгированная с синим красителем) с HbA1C после лизиса эритроцитов и преципитации гемоглобина ZnCl2. Эти процессы идут одновременно в течение 2 мин при добавлении 3,5 мкл цельной крови к 200 мкл специального реагента при перемешивании. 25 мкл смеси наносят на пористый фильтр, как и в двух описанных выше тест-системах. Излишки реагентов удаляют каплей промывающего раствора. Преципитат анализируют с помощью денситометра “НикоКард — Ридер”, измеряя интенсивность синего (гликозилированный гемоглобин, 620 нм) и красного (общий гемоглобин, 460 нм) окрашивания соответственно. Отношение 620:460 нм пропорционально проценту HbA1C в образце и вычисляется автоматически. Нормальные значения в крови — 4,5-6% HbA1C. Тест-система работает в диапазоне 4-18% HbA1C, не интерферирует с другими компонентами сыворотки, показывает хорошую воспроизводимость и корреляцию с HPLC [6].

Литература

1. Калинин Н. Л., Корнев А. В., Рыбкин Ю. Б. и сотр. // Клин. лабор. диагн. 1996. № 2. С. 35-38.
2. Лабораторные методы исследования в клинике // Под ред. В. В. Меньшикова. М., 1987.
3. Энциклопедия клинических лабораторных тестов // Под ред. Н. У. Тица и В. В. Меньшикова. М., 1997.
4. Dale S., Gogstad G. O., Brosstad F. et al. // Thromb. and Haemostasis. 1994. Vol. 71, № 3. P. 270-274.
5. Fassbender R., Pargger H., Muller W., Zimmerli W. // Crit. Care Med. 1993. Vol. 41, № 5. P. 471-476.
6. Frantzen F., Lovli T., Faaren A. L. et al. // Axis Biochemicals AS, Oslo, Norway, R&D Section, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway, 1998.
7. Gogstad G. O., Dale S., Brosstad F. et al. // Clin. Chem. 1993. Vol. 39, № 10. P. 2070-2076.
8. Melbye H., Berdal B. H., Straume B. et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1992. № 24. P. 647-655.
9. Urdal P., Borch S. M., Landaas S. et al. // Clin. Chem. 1992. Vol. 38, № 4. P. 580-584.